【摘要】：肥胖胰島素抵抗是發(fā)展為2型糖尿病的關(guān)鍵誘因之一。在肥胖早期,胰島β細(xì)胞代償性分泌胰島素增多以平衡內(nèi)環(huán)境血糖穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致血中胰島素水平明顯升高。隨著病程延長(zhǎng),胰島β細(xì)胞持續(xù)超負(fù)荷工作步入失代償期,最終導(dǎo)致T2DM時(shí)胰島β細(xì)胞功能衰竭。因此闡明β細(xì)胞過度分泌胰島素,加速失代償進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制對(duì)于T2DM早期預(yù)防及治療有著重要意義。近年來,調(diào)控著復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的microRNAs(miRNAs)受到了廣泛的關(guān)注,其中多種miRNAs被證實(shí)參與β細(xì)胞功能的調(diào)控。課題組前期研究表明,在眾多的miRNA中,miR-27a與肥胖胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),參與了肥胖代謝綜合征以及2型糖尿病中多個(gè)糖脂代謝靶器官胰島素抵抗的發(fā)生。但miR-27a對(duì)肥胖胰島素抵抗模型中胰島β細(xì)胞過度分泌胰島素的影響尚不清楚。通過基因預(yù)測(cè)及在Targetscan等網(wǎng)站的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,miR-27a與胰島β細(xì)胞關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的3’UTR端具有高度互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)多種組織細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,miR-27a可以與FoxO1的mRNA結(jié)合抑制Fox O1的轉(zhuǎn)錄,提示Fox O1可能是miR-27a的潛在靶點(diǎn)。Fox O1為叉頭框架蛋白Fox家族的一員,在胰島β細(xì)胞中高表達(dá),作為核轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控胰島β細(xì)胞多種生理功能。研究表明,FoxO1可以與PDX1啟動(dòng)子結(jié)合負(fù)向調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過程,而PDX1是調(diào)控胰島素合成的胰島特異關(guān)鍵蛋白之一。同時(shí),PDX1在基因水平上可以促進(jìn)β細(xì)胞特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT2和游離脂肪酸受體GPR40表達(dá)。而GLUT2及GPR40在葡萄糖刺激及中長(zhǎng)鏈游離脂肪酸刺激的胰島素分泌過程中發(fā)揮著重要作用。由此可見,FoxO1表達(dá)下調(diào)后能夠促進(jìn)PDX1的表達(dá),而PDX1能夠一方面參與胰島素合成,一方面通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT2及脂肪酸受體GPR40增加胰島素分泌,而在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下胰島β細(xì)胞過度分泌胰島素可能會(huì)加速胰島β細(xì)胞的衰竭,進(jìn)而推動(dòng)肥胖誘導(dǎo)2型糖尿病發(fā)生。鑒于課題組前期研究結(jié)果表明miR-27a參與肥胖胰島素抵抗的發(fā)生,而Fox O1是其重要的下游調(diào)控靶點(diǎn),我們推測(cè)在肥胖胰島素抵抗過程中,miR-27a影響胰島β細(xì)胞過度分泌胰島素的調(diào)控機(jī)制可能是通過Fox O1-PDX1-GLUT2/GPR40通路完成的。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本課題通過建立長(zhǎng)期高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖胰島素抵抗小鼠模型以及高脂飲食喂養(yǎng)miR-27a慢病毒沉默小鼠模型,觀察mi R-27a對(duì)肥胖誘導(dǎo)胰島素抵抗下β細(xì)胞過度分泌胰島素的影響;通過在MIN6細(xì)胞中過表達(dá)miR-27a及Fox O1,闡明miR-27a通過FoxO1促進(jìn)胰島素分泌的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.整體水平探討miR-27a在肥胖胰島素抵抗β細(xì)胞過度分泌胰島素中的作用:建立高脂喂養(yǎng)肥胖胰島素抵抗小鼠模型,檢測(cè)生理生化指標(biāo)、OGTT、ITT確定小鼠肥胖及胰島素抵抗情況;GSIS、胰島組織學(xué)染色和胰島素免疫組化確定β細(xì)胞形態(tài)及功能變化;建立miR-27a慢病毒沉默高脂喂養(yǎng)小鼠模型,ELISA試劑盒檢測(cè)空腹胰島素水平;RT-PCR法檢測(cè)肥胖胰島素抵抗小鼠及miR-27a慢病毒沉默小鼠胰島組織中的miR-27a和Fox O1水平;Western blot法檢測(cè)FoxO1及與β細(xì)胞增殖及胰島素合成分泌相關(guān)蛋白PDX1、GLUT2、GPR40的表達(dá)情況。2.細(xì)胞水平闡述miR-27a通過調(diào)控FoxO1在β細(xì)胞過度分泌胰島素中的分子機(jī)制:通過轉(zhuǎn)染的方法將MIN6細(xì)胞分為三組:對(duì)照組、過表達(dá)miR-27a組、miR-27a聯(lián)合Fox O1同時(shí)過表達(dá)組。使用熒光顯微鏡通過拍攝不同的熒光顏色鑒定轉(zhuǎn)染效率;通過胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)基礎(chǔ)水平及葡萄糖短時(shí)刺激分泌的胰島素水平;ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中ATP水平;RT-PCR法檢測(cè)miR-27a、FoxO1、PDX1、GLUT2、GPR40的mRNA表達(dá)情況;Western blot法檢測(cè)FoxO1、PDX1、GLUT2、GPR40蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.miR-27a在肥胖胰島素抵抗β細(xì)胞過度分泌胰島素中的作用研究:生理生化指標(biāo)結(jié)果顯示,高脂飲食小鼠的體重、身體脂肪含量百分率,血糖、血脂及血清胰島素含量均明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),高脂模型組肥胖小鼠OGTT、ITT曲線的整體趨勢(shì)及曲線下面積大于低脂對(duì)照組小鼠且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明肥胖小鼠模型具有胰島素抵抗的特點(diǎn),模型制備成功。高脂模型組小鼠的GSIS曲線趨勢(shì)及曲線下面積明顯低于低脂對(duì)照組小鼠,HE染色及胰島素免疫組化結(jié)果顯示高脂模型組小鼠胰島面積增加形態(tài)發(fā)生變化,胰島素合成增多,同時(shí)與增殖及胰島素合成分泌相關(guān)的蛋白PDX1、GLUT2、GPR40表達(dá)升高,表明胰島β細(xì)胞出現(xiàn)增殖,胰島素合成分泌水平升高,但是對(duì)于響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌胰島素的敏感性下降的現(xiàn)象。RT-PCR結(jié)果表明,與低脂對(duì)照組相比,高脂模型組胰島組織中mi R-27a含量升高,Fox O1的mRNA含量降低,同時(shí)Fox O1蛋白表達(dá)降低(P0.05),說明肥胖胰島素抵抗小鼠胰島素合成分泌升高可能與miR-27a有關(guān),同時(shí)miR-27a有可能是通過影響Fox O1發(fā)揮作用。高脂飲食喂養(yǎng)miR-27a慢病毒沉默小鼠模型結(jié)果顯示,與高脂慢病毒空載組相比,高脂飲食喂養(yǎng)miR-27a慢病毒沉默小鼠的胰島組織中miR-27a含量明顯下降,說明miR-27a的過度表達(dá)成功被抑制,同時(shí)miR-27a慢病毒沉默小鼠的空腹胰島素水平明顯降低,FoxO1的m RNA含量有所回升(P0.05),進(jìn)一步說明miR-27a可能以FoxO1為靶點(diǎn)在促進(jìn)胰島素分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-27a可能參與肥胖胰島素抵抗β細(xì)胞胰島素分泌增加的過程,并且可能是通過調(diào)節(jié)Fox O1發(fā)揮作用。2.miR-27a通過調(diào)控FoxO1在β細(xì)胞過度分泌胰島素中的分子機(jī)制研究:細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,熒光顯微鏡圖片顯示轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率均非常高,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);上清液中基礎(chǔ)累積胰島素結(jié)果顯示,單獨(dú)過表達(dá)miR-27a組的胰島素含量增加,同時(shí)過表達(dá)mi R-27a與Fox O1組的胰島素含量降低,胰島素分泌能量代謝關(guān)鍵指標(biāo)ATP的檢測(cè)結(jié)果也呈現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)(P0.01)。葡萄糖刺激MIN6細(xì)胞的胰島素分泌變化結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-27a時(shí)MIN6細(xì)胞對(duì)于高糖刺激分泌胰島素的敏感性相比于對(duì)照組明顯下降,而同時(shí)過表達(dá)miR-27a及FoxO1組中響應(yīng)高糖刺激而分泌胰島素的的敏感性則有了一定程度的改善。RT-PCR結(jié)果顯示,在MIN6細(xì)胞中過表達(dá)miR-27a時(shí),FoxO1的mRNA水平下降同時(shí)PDX1、GLUT2、GPR40的mRNA水平升高,而在同時(shí)過表達(dá)組中這種趨勢(shì)則被逆轉(zhuǎn)(P0.05)。蛋白水平結(jié)果顯示,在過表達(dá)miR-27a組中,Fox O1的蛋白水平下降,PDX1、GLUT2、GPR40的蛋白表達(dá)水平升高,而在同時(shí)過表達(dá)miR-27a及FoxO1組中則出現(xiàn)了相反的趨勢(shì)(P0.05)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-27a可以通過抑制Fox O1促進(jìn)基礎(chǔ)胰島素分泌,其機(jī)制可能是由于miR-27a抑制FoxO1的m RNA表達(dá),從基因水平上調(diào)胰島β細(xì)胞中增殖及胰島素合成分泌相關(guān)蛋白PDX1-GLUT2/GPR40通路,進(jìn)而促進(jìn)胰島素過度分泌。結(jié)論:miR-27a能夠促進(jìn)肥胖胰島素抵抗下胰島β細(xì)胞過度分泌胰島素,其機(jī)制可能是通過抑制FoxO1的mRNA表達(dá),進(jìn)而上調(diào)胰島素合成分泌相關(guān)蛋白PDX1-GLUT2/GPR40的mRNA及蛋白水平,促進(jìn)胰島β細(xì)胞胰島素合成分泌增加,提示miR-27a可能是加速肥胖胰島素抵抗胰島β細(xì)胞失代償?shù)闹匾悬c(diǎn)。
【圖文】：

圖 3.1 肥胖小鼠 12w 時(shí)葡萄糖耐量及胰島素耐量結(jié)果LF:低脂對(duì)照組，HF：高脂模型組*P<0.05, **P<0.01 compared with LF groupA. 葡萄糖耐量曲線（OGTT） B. OGTT 曲線下面積 C. 胰島素耐量曲線（ITT）D. ITT 曲線下面積3.1.3 肥胖胰島素抵抗小鼠葡萄糖刺激的胰島素分泌結(jié)果為了探究肥胖小鼠胰島合成分泌胰島素功能的變化，我們檢測(cè)了葡萄糖刺激的胰島素分泌情況。如圖 3.2 結(jié)果顯示，盡管 HF 組小鼠空腹基礎(chǔ)胰島素水平高于 LF 組小鼠（表 3.1），但其胰島對(duì)于短時(shí)葡萄糖刺激而分泌產(chǎn)生的胰島素較 LF組顯著降低，同時(shí)曲線下面積也小于 LF 組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明HF 組小鼠的胰島對(duì)于口服短時(shí)葡萄糖刺激分泌胰島素的敏感性較 LF 組小鼠明顯下降。

圖 3.2 肥胖胰島素抵抗小鼠葡萄糖刺激的胰島素分泌結(jié)果LF:低脂對(duì)照組，HF：高脂模型組*P<0.05 compared with LF groupA. 葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線（GSIS） B. GSIS 曲線下面積3.1.4 肥胖胰島素抵抗小鼠胰島形態(tài)學(xué)變化為了進(jìn)一步探究肥胖小鼠胰島形態(tài)學(xué)以及功能的變化，取肥胖小鼠胰島固定切片進(jìn)行了 HE 染色及胰島素免疫組化實(shí)驗(yàn)。如圖 3.3，HE 結(jié)果顯示 LF 組正常胰島為近似橢圓形或圓形，而 HF 組胰島面積增加且輪廓形狀趨于不規(guī)則，同時(shí)HF 組小鼠胰島的形狀因子（SF）明顯大于 LF 組，說明其胰島形態(tài)發(fā)生了變化。胰島素免疫組化結(jié)果可見，HF 組的 Ins+/Isl 比值略大于 LF 組，，說明胰島中具備分泌胰島素能力的β細(xì)胞數(shù)量有一定增加。HF 組 IOD/ Isl 的比值約為 LF 組的兩倍，提示 HF 組小鼠單位面積上胰島細(xì)胞分泌胰島素的負(fù)荷遠(yuǎn)大于 LF 組小鼠。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 Zahra Niki Boroujeni;Ahmad Aleyasin;;Insulin producing cells established using non-integrated lentiviral vector harboring PDX1 gene[J];World Journal of Stem Cells;2013年04期

本文編號(hào)：2609132