發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 12:02

【摘要】：卵磷脂是一類(lèi)普遍存在于生物界中的寶貴含磷類(lèi)脂物質(zhì)。卵磷脂作為構(gòu)成生物體核膜、細(xì)胞膜及質(zhì)體膜等生物膜中類(lèi)脂的重要成分,在維持生物細(xì)胞膜的生理功能和正常機(jī)體代謝方面具有十分關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。鑒于卵磷脂分子具有特殊的雙極性結(jié)構(gòu),既含有親脂性的脂肪酸烴的非極性端,又含有親水性的膽堿基、磷酸根的極性端。卵磷脂這種特殊的分子結(jié)構(gòu)決定了其具有多種生理活性和物化特性,可廣泛應(yīng)用在化妝品、食品及醫(yī)藥等行業(yè)中,是制備和生產(chǎn)各類(lèi)醫(yī)藥制劑的輔料、乳化劑、調(diào)理劑及增溶劑等的理想原料。由于藥用輔料的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化在我國(guó)一直是比較薄弱的環(huán)節(jié),同時(shí)藥用卵磷脂(口服與注射級(jí)別)產(chǎn)品研究開(kāi)發(fā)的時(shí)間比較晚,而且其提取工藝技術(shù)復(fù)雜、難度大,而世界上能夠掌握既有高純度又能保持活性的藥用卵磷脂生產(chǎn)技術(shù)僅有國(guó)外少數(shù)公司。目前,我國(guó)基本全部依靠進(jìn)口藥用卵磷脂來(lái)滿(mǎn)足靜脈注射脂肪乳和脂質(zhì)體的生產(chǎn)需要。本研究以超臨界CO_2萃取玉米油后的萃余物脫脂玉米胚芽為原料,采用超聲波微波協(xié)同乙醇提取玉米卵磷脂(口服與注射兩用),使PC、PE及LPC的含量符合進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的范圍要求。然后對(duì)玉米卵磷脂的理化特性、磷脂組成、性質(zhì)表征及乳化特性進(jìn)行研究,最后構(gòu)建高脂血癥大鼠模型,對(duì)玉米卵磷脂(口服與注射兩用)進(jìn)行降血脂功效及急性毒性評(píng)價(jià)。我國(guó)玉米胚芽資源豐富,加工利用率較低,本研究成果如能在實(shí)際應(yīng)用中得以順利開(kāi)展,不僅可大幅度提高玉米胚芽的附加值,延長(zhǎng)玉米精深加工產(chǎn)業(yè)鏈,產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)及環(huán)境效益,還有助于緩解口服用和注射用卵磷脂長(zhǎng)期依靠進(jìn)口的形勢(shì),具有顯著的應(yīng)用價(jià)值與廣闊的市場(chǎng)前景。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)以超臨界CO_2脫脂后玉米胚芽為原料,采用超聲波微波協(xié)同乙醇提取玉米粗卵磷脂,通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察料液比、超聲波功率、微波溫度和協(xié)同作用時(shí)間對(duì)玉米粗卵磷脂提取率的影響,固定乙醇濃度為95%。結(jié)果表明,最佳提取工藝條件為:料液比(g/mL)1:10、超聲波功率230W、微波溫度55℃、協(xié)同作用時(shí)間20min,在此條件下玉米粗卵磷脂的提取率為(81.24±2.35)%,顯著高于超聲波協(xié)同乙醇提取法、微波協(xié)同乙醇提取法和單獨(dú)乙醇提取法。UPLC-ELSD法分析結(jié)果表明,玉米粗卵磷脂中PC含量最高,達(dá)到(62.25±2.12)%,PE含量次之,達(dá)到(26.67±0.35)%,而LPC的含量?jī)H為(1.32±0.08)%。此外,玉米粗卵磷脂樣品中還有少量的未知組分有待進(jìn)一步研究。(2)以玉米粗卵磷脂為原料,采用乙醇冷凍純化法提取玉米卵磷脂(口服與注射兩用),通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察料液比、乙醇濃度、冷凍溫度和冷凍時(shí)間對(duì)玉米卵磷脂的提取率,PC含量,PE含量的影響。結(jié)果表明,最佳工藝條件為:料液比(g/mL)1:9、乙醇濃度95%、冷凍溫度-14℃、冷凍時(shí)間45min,在此條件下玉米卵磷脂的提取率為(79.35±1.22)%,PC含量為(78.37±0.17)%,PE含量為(9.86±0.07)%,符合進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)(JX20010249)的要求。(3)采用TLC及UPLC-ELSD法分析玉米卵磷脂(口服與注射兩用)中的磷脂組成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC含量最高,PE含量次之,而LPC的含量?jī)H為(1.32±0.08)%,磷脂組成均符合進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)(JX20010249)和《中國(guó)藥典》2015年版的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。對(duì)制備的玉米卵磷脂的重要質(zhì)量指標(biāo)相關(guān)的理化特性進(jìn)行分析,結(jié)果表明產(chǎn)品各指標(biāo)均在《中國(guó)藥典》2015年版的可接受范圍之內(nèi),甚至有些指標(biāo)結(jié)果優(yōu)于前人報(bào)道的注射級(jí)大豆卵磷脂。(4)采用FT-IR對(duì)玉米卵磷脂(口服與注射兩用)樣品進(jìn)行性質(zhì)表征分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中在磷脂的特征官能團(tuán)譜帶強(qiáng)度較強(qiáng),可知樣品中磷脂含量較高。采用GC-MS對(duì)玉米卵磷脂樣品、PC和PE組分的脂肪酸組成鑒定分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種脂質(zhì)均含有大量的亞油酸和油酸。對(duì)于亞油酸,PE組分含量最高,達(dá)到60.95%,玉米卵磷脂樣品含量最低,只有45.99%。PC組分中油酸含量最高,達(dá)到24.51%。玉米卵磷脂樣品中脂肪酸主要由棕櫚酸(18.81%)、硬脂酸(3.92%)、油酸(22.31%)、亞油酸(45.99%)和亞麻酸(7.66%)組成,n-6/n-3比率(6.00)在世界衛(wèi)生組織建議的安全值的可接受范圍內(nèi)。采用UPLC-ESI-TQ-MS/MS對(duì)玉米卵磷脂中不同磷脂組分的分子種類(lèi)和含量進(jìn)行分析,共檢出6種PC和6種PE分子種類(lèi)。PC類(lèi)磷脂中,PC(36:3)、PC(34:2)和PC(36:2)分子種類(lèi)的相對(duì)含量較高,而在PE類(lèi)磷脂中,相對(duì)含量較高的分子種類(lèi)為PE(36:4)和PE(34:2)。此外,PC和PE的溶血磷脂均由LPL(16:0)和LPL(18:0)這兩種分子種組成,而且兩者的相對(duì)含量都很低。將UPLC-ESI-TQ-MS/MS測(cè)定的所有脂肪酸鏈種類(lèi)及相對(duì)含量與GC-MS分析結(jié)果相比較,表征結(jié)果高度吻合。(5)玉米卵磷脂(口服與注射兩用)O/W型乳液的乳化穩(wěn)定性、粒徑分布及乳液微觀形態(tài)分析與表征結(jié)果表明,增加乳化劑卵磷脂濃度可使乳液液滴尺寸減小,乳液穩(wěn)定性增加。與添加相同濃度的注射用蛋黃卵磷脂作為乳化劑相比,玉米卵磷脂制備的O/W型乳液的穩(wěn)定性更好。(6)構(gòu)建高脂血癥大鼠模型,對(duì)玉米卵磷脂(口服與注射兩用)進(jìn)行降血脂功分析,結(jié)果表明采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠2周后,通過(guò)尾靜脈采血,測(cè)得模型組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均顯著高于空白對(duì)照組,表明高脂血癥大鼠模型造模成功;通過(guò)分析大鼠血清指標(biāo)數(shù)據(jù),與模型組比較,高劑量組和中劑量組可明顯降低高脂血癥大鼠血清中TC和TG含量,而且高劑量組能顯著降低LDL-C水平和提升HDL-C水平,表明高劑量組對(duì)高脂膳食大鼠血脂具有明顯的降低作用;玉米卵磷脂能顯著降低大鼠腹腔脂肪蓄積系數(shù),且高劑量組優(yōu)于其他各組;通過(guò)對(duì)大鼠肝臟中SOD和MDA含量進(jìn)行分析,高劑量組能顯著降低大鼠肝臟內(nèi)MDA含量,提升肝臟內(nèi)SOD水平,說(shuō)明玉米卵磷脂具有抑制肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化和提高肝組織抗氧化能力的作用;從大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察來(lái)看,玉米卵磷脂(口服與注射兩用)可改善高脂血癥大鼠肝細(xì)胞脂肪變性損傷,其中以高劑量組的改善效果最佳。綜上說(shuō)明玉米卵磷脂具有輔助降血脂、保護(hù)肝臟功能。(7)小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,玉米卵磷脂(口服與注射兩用)最大灌胃給藥量為28g/(kg·d),此劑量相當(dāng)于臨床劑量的235倍,給小鼠灌胃后,小鼠體重增值屬于正常增長(zhǎng)范圍,未出現(xiàn)有中毒或者死亡現(xiàn)象,剖檢后也沒(méi)發(fā)現(xiàn)組織臟器有明顯變化。與空白組比較,給藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明玉米卵磷脂安全可靠,屬于無(wú)毒級(jí)。
【圖文】：

準(zhǔn)確稱(chēng)取25.00g脫脂玉米胚芽，以一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液，，在溫和的氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下置于微波-紫外-超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀中，并與球形冷凝器連接（如圖2.1所示）。設(shè)定磁力攪拌速度為300r/min，在一定的超聲波功率和微波溫度下協(xié)同作用一段時(shí)間，過(guò)濾取濾液，提取次數(shù)為2次。合并濾液，于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除乙醇，加入35mL乙醚于蒸餾瓶中，充分溶解殘留物，過(guò)濾取濾液。然后將濾液轉(zhuǎn)移到冰浴（0℃）的燒瓶中，參考美國(guó)油脂化學(xué)協(xié)會(huì)（AOCS）標(biāo)準(zhǔn)方法AOCS Official Method Ja 4 46加入140mL冷丙酮（4℃），充分?jǐn)嚢�，傾析上清液，用20mL冷丙酮多次洗滌沉淀直至上清液無(wú)油跡為止[10, 92]。最后沉淀物用溫和的氮?dú)饬鞔蹈?

然后分別移取每支比色管上層液倒入潔凈、干燥的比色皿中，于650nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，含磷量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖2.2。得到的線性方程為：y=5.5279x+0.0051，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，呈良好的線性關(guān)系。其中y為吸光度，x為磷含量（mg）。2.2.4.3 玉米粗卵磷脂樣品中磷脂含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1-0.2g玉米粗卵磷脂樣品置于50mL的石英坩堝中，加入0.5g氧化鋅搖勻后放在萬(wàn)用電爐上慢火加熱至樣品變稠，然后逐漸加熱至樣品全部炭化。將石英坩堝置于馬
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TS218;R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2607519