【摘要】：目的:骨橋蛋白(OPN)是一種分泌的多功能糖蛋白,參與免疫反應(yīng)、炎癥、腫瘤形成和代謝等多種病理生理過程。OPN以兩種形式存在,即分泌型OPN(sOPN)和胞內(nèi)型OPN(iOPN)。盡管它們可能具有不同的生物學(xué)活性,但它們對棕色脂肪細(xì)胞分化的影響尚未完全闡明。因此,本研究旨在探討sOPN在白色脂肪棕色化中的作用及其機(jī)制,并探討未修飾人重組OPN(rhOPN)作為iOPN的替代物,是否具有類似的作用和機(jī)制。方法:首先,3T3-L1前脂肪細(xì)胞分別用含有rhOPN(10,50,100,200μM)的DMI誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),并設(shè)置用含磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)基代替rhOPN處理的為Vehicle組,誘導(dǎo)分化6天后,設(shè)立分組為Ctrl組、Vehicle組、rhOPN(200μM)組;另一方面,用特異性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN感染另一組3T3-L1細(xì)胞后用DMI誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化,并同時用陰性對照腺病毒(Vehicle)處理作為對照,設(shè)立分組為Ctrl組、Vehicle組、Ad-GFP-ap2-OPN組。其次,分別用CD44抗體和免疫球蛋白(Ig G)處理感染過特異性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN的細(xì)胞,并如上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)6天,分別設(shè)置anti-CD44組、Ig G組。最后,檢測以下指標(biāo):(1)通過MTS法檢測rhOPN處理3T3-L1細(xì)胞后的細(xì)胞活力;(2)通過ELISA法檢測sOPN的表達(dá)水平;(3)油紅O染色觀察3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況;(4)Western blotting法分別檢測與棕色脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的markers如UCP-1、PRDM16、PGC-1α、PPARγ等蛋白表達(dá)水平;檢測細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、AKT、AKT-pS473的蛋白表達(dá)水平以探討作用機(jī)制。結(jié)果:(1)油紅O染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)培養(yǎng)6天時,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚集,脂肪細(xì)胞基本誘導(dǎo)成熟。(2)用不同滴度特異性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1細(xì)胞后,在熒光倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞在病毒滴度為1×10~8PFU感染48h時細(xì)胞未見明顯損傷并且綠色熒光強(qiáng)度最高。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇最佳感染病毒滴度為1×10~8PFU,最佳感染時間為48h。(3)ELISA法檢測結(jié)果顯示:用特異性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1細(xì)胞后分泌sOPN的水平上升。(4)MTS法檢測結(jié)果顯示:用由不同濃度的rhOPN來替代欠修飾的iOPN處理脂肪細(xì)胞后,細(xì)胞活力沒有受到明顯的影響。(5)油紅O結(jié)果顯示:感染特異性腺病毒上調(diào)sOPN后,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚集,而用rhOPN處理后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)并沒有明顯聚集現(xiàn)象。(6)Western blotting測定結(jié)果顯示:用腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染的3T3-L1細(xì)胞內(nèi)UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等蛋白的表達(dá)水平顯著升高;而用rhOPN處理后的細(xì)胞內(nèi)上述相應(yīng)蛋白卻沒有明顯的上升趨勢。(7)確認(rèn)sOPN上調(diào)促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞棕色化后,油紅O結(jié)果顯示:用CD44抗體中和CD44受體后,對比空白對照Ig G組,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集受到明顯的抑制。(8)Western blotting測定結(jié)果顯示:對比空白對照Ig G組,中和CD44受體后,UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等棕色化相關(guān)蛋白的表達(dá)受到明顯的抑制,并且相關(guān)通路蛋白p-PI3K、AKT-pS473的表達(dá)也受到明顯的抑制。結(jié)論:sOPN具有促進(jìn)白色前脂肪細(xì)胞棕色化的能力,其作用機(jī)制可能是依賴于與細(xì)胞膜上的CD44受體結(jié)合的。然而,rhOPN則未發(fā)現(xiàn)具有上述效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2

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本文編號：2601843