【摘要】：目的1、建立小鼠過敏性哮喘模型,觀察哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道反應性變化,探討小鼠哮喘上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子學調控機制。2、觀察經(jīng)IKKβ酶抑制劑BMS-345541、溴化結構域蛋白抑制劑JQ1干預對哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑及EMT的影響,為更好的防治哮喘氣道重塑提供新的理論研究依據(jù)。方法1、小鼠隨機分成卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導哮喘組(OVA組)、正常對照組(對照組),每組8只,OVA組利用OVA加氫氧化鋁(AL(OH)3)凝膠間隔7天連續(xù)致敏三次后再每日5%OVA霧化激發(fā)7天,建立小鼠哮喘模型。對照組在同樣的周期內用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)替代OVA進行致敏和激發(fā)。觀察指標:(1)小鼠霧化激發(fā)時的行為觀察;(2)通過動物肺功能儀采用整體體積描記法測定肺阻力(Lung resistance,RL),觀察霧化吸入遞增濃度乙酰膽堿(acetylcholine chloride,Ach)后小鼠RL的變化;(3)計算肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細胞總數(shù)與嗜酸性粒細胞百分比;(4)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)實驗測定血清及BALF中轉化生長因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)的濃度;(5)肺組織切片行蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosin,HE)染色、過碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色及改良Weigert間苯二酚復紅染色法觀察小鼠肺組織形態(tài)學改變;(6)實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測哮喘小鼠EMT相關鈣粘蛋白(E-Cadherin)及波形蛋白(vimentin)基因信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表達水平;(7)western blot檢測E-Cadherin及vimentin蛋白表達水平。2、在成功建立小鼠哮喘模型的基礎上將小鼠隨機分成OVA組、BMS-345541干預組(BMS+OVA組),同時設立正常對照組及二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)干預對照組(DMSO+OVA組),每組8只,其中BMS+OVA組小鼠于每次5%OVA霧化激發(fā)前將BMS-345541溶液(50μg/g)經(jīng)胃管注入OVA哮喘小鼠連續(xù)進行干預7天,干預對照組(DMSO+OVA組)同樣予喂食針注入同等劑量的DMSO溶液。觀察指標:(1)各組小鼠霧化激發(fā)時的行為觀察;(2)RL值測定;(3)計算BALF中細胞總數(shù)與多種細胞分類(巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等)的百分比;(4)ELISA測定血清及BALF中TGFβ1濃度;(5)HE、PAS染色及改良Weigert間苯二酚復紅染色觀察肺組織形態(tài)學改變;(6)測定氣管管壁上皮厚度;(7)免疫組化染色觀察哮喘小鼠E-Cadherin及vimentin表達,測定其陽性表達單位面積累積光密度值(integrated option density,IOD);(8)RT-qPCR檢測E-Cadherin及vimentin基因mRNA表達水平;(9)western blot檢測E-Cadherin及vimentin蛋白表達水平。3、將24只小鼠隨機分成OVA組、JQ1干預組(JQ1+OVA組)及正常對照組(對照組),每組8只,成功建立OVA小鼠哮喘模型,在OVA哮喘模型基礎上JQ1+OVA組小鼠于每次5%OVA霧化激發(fā)前經(jīng)腹腔注入JQ1溶液(50μg/g)進行干預,連續(xù)7天。觀察指標:(1)各組小鼠霧化激發(fā)時的行為觀察;(2)BALF中細胞總數(shù)與嗜酸性粒細胞百分比變化;(3)HE、PAS及改良Weigert間苯二酚復紅染色觀察肺組織形態(tài)學變化;(4)RT-qPCR檢測E-Cadherin及vimentin基因mRNA表達水平;(5)western blot檢測E-Cadherin及vimentin蛋白表達水平。結果1.第一部分實驗結果(1)行為表現(xiàn):OVA致敏哮喘小鼠經(jīng)霧化激發(fā)后較正常對照小鼠明顯出現(xiàn)煩躁不安、活動減少、呼吸困難、大小便失禁等哮喘發(fā)作表現(xiàn)。(2)肺組織病理染色形態(tài)學改變:OVA致敏激發(fā)哮喘小鼠肺內可見大量炎性細胞浸潤,氣道壁增厚、破壞明顯,氣管痙攣,管腔變狹窄,杯狀細胞增生,粘液腺分泌增加,粘液栓形成,彈力纖維增生。(3)RL測定結果:OVA組小鼠RL值隨Ach吸入濃度的增加而逐漸升高,與正常對照組小鼠比較差異顯著(P㩳0.01)。(4)BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比:與對照組比較,OVA組小鼠BALF細胞總數(shù)及細胞分類中嗜酸性粒細胞百分比均明顯增多(P㩳0.01)。(5)血清及BALF中TGFβ1濃度測定:OVA組小鼠血清及BALF的TGFβ1濃度均較對照組升高(P㩳0.01)。(6)E-Cadherin及vimentin的mRNA基因水平及蛋白水平表達:OVA組E-Cadherin基因及蛋白表達降低,而vimentin基因及蛋白表達升高(P㩳0.05),各組小鼠基因表達與蛋白表達水平相一致。2.BMS-345541干預后結果(1)經(jīng)BMS-345541干預后哮喘小鼠在OVA激發(fā)時哮喘樣發(fā)作及呼吸困難的癥狀緩解、減輕。(2)肺組織病理染色可見炎性細胞浸潤減少,粘液腺分泌減輕,杯狀細胞增生減少,彈力纖維增生減輕。(3)BMS+OVA小鼠RL值較OVA組降低明顯(P㩳0.01)。(4)BMS+OVA小鼠BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比降低(P㩳0.05)。(5)BMS+OVA小鼠氣管管壁上皮厚度減少(P㩳0.001)。(6)BMS+OVA小鼠血清及BALF中TGFβ1濃度(42.04±28.38 pg/ml,25.45±14.15 pg/ml),與OVA組(84.41±38.18 pg/ml,44.36±10.98pg/ml)比較有明顯降低(P㩳0.05)。(7)BMS+OVA組小鼠肺組織E-Cadherin免疫組化陽性表達單位面積IOD值0.22±0.07,vimentin的IOD值0.17±0.04,與OVA組比較BMS+OVA組E-Cadherin表達增強,而vimentin表達減弱(P㩳0.05)。(8)OVA+BMS組小鼠E-Cadherin基因mRNA及蛋白表達水平上調,vimentin基因mRNA及蛋白表達水平下調(P㩳0.05)。(9)BMS+OVA組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。3.JQ1干預后結果(1)哮喘小鼠經(jīng)JQ1干預后哮喘發(fā)作癥狀緩解。(2)與OVA組比較,JQ1+OVA組小鼠氣道炎性細胞浸潤減少,氣管壁破壞、氣道痙攣減輕,粘液滲出及杯狀細胞增生減少,彈力纖維增生減輕。(3)JQ1+OVA組小鼠BALF中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比減少(P㩳0.01)。(4)JQ1+OVA組小鼠E-Cadherin mRNA及蛋白表達明顯增強,vimentin mRNA及蛋白表達明顯減弱(P㩳0.01),各組小鼠基因表達與蛋白表達水平相一致。(5)JQ1+OVA組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。結論1、OVA致敏和激發(fā)可以成功誘導小鼠過敏性哮喘模型的建立。2、OVA哮喘小鼠存在明顯氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑。3、OVA哮喘小鼠TGFβ1分泌增加,TGFβ1可能與哮喘EMT相關。4、OVA哮喘小鼠氣道重塑存在EMT,細胞粘附分子E-cadherin表達減少,細胞骨架蛋白vimentin表達增多可導致EMT的發(fā)生。5、IKKβ酶抑制劑BMS-345541和溴化結構域蛋白抑制劑JQ1均可明顯降低哮喘小鼠氣道炎癥,抑制EMT,減輕氣道重塑。6、氣道重塑EMT與TGFβ1、NF-κB、BRD4的分子調控有關,NF-κB/RelA-BRD4信號通路調控將為哮喘未來的治療提供新的靶向。
【圖文】：

第一部分 小鼠哮喘模型建立及哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑及 EMT 分子機制的實驗研究2.2 哮喘模型的建立哮喘小鼠分別于第 1、7、14 天給予腹腔注射 OVA 混懸液 0.5ml，使小鼠致敏；在第21-28天時將小鼠放進自制的有機玻璃盒中給予霧化吸入5% OVA激發(fā)，每天 30min，持續(xù) 7 天[38]。對照組小鼠所有致敏與激發(fā)均用等量 PBS 液代替，哮喘動物模型建立的整個實驗流程見圖 1。

圖 3.TGF-β1 標準曲線圖. 實時熒光定量聚合酶鏈反應（ real-time quantitative polymerase chaeaction，RT-qPCR）法測定 E-Cadherin、vimentin 的 mRNA 表達.1 提取總 RNA實驗過程嚴格按超純RNA提取試劑盒要求執(zhí)行。實驗前預先準備好無Rna塑料制品和槍頭，避免交叉污染。玻璃器皿應在使用前給予高壓滅菌，塑皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10min，用水徹底沖洗后高壓滅菌。配制溶液應無 Rnase 的水。具體實驗步驟如下：（1）取小鼠肺組織盡量剪碎，每 30-50mg 組織加入 1m1 的 TRIzol Reagen復吹打，研磨組織，使樣本充分裂解，室溫放置 5 分鐘，使蛋白核酸復合全分離。（2）以每 1mlTRIzol Reagent 加入 200μl 氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋烈振蕩 15s，充分混勻，室溫放置 2 分鐘。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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1 朱曉華;李秋根;汪俊;胡國柱;劉志強;胡清華;吳剛;;溴化結構域蛋白抑制劑JQ1對哮喘小鼠氣道重塑作用機制研究[J];中國當代兒科雜志;2017年12期

2 朱曉華;陳強;李秋根;李嵐;柯江維;劉志強;冉飛;;兒童巨細胞病毒感染致喘息發(fā)生的免疫學機制[J];中國當代兒科雜志;2016年09期

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本文編號：2598187