【摘要】：研究背景2型糖尿病大血管病變是許多糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥的常見病理基礎(chǔ),如冠心病、腦卒中及周圍血管疾病等。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,約80%糖尿病患者最終會死于心血管疾病,粥樣斑塊破裂導(dǎo)致的急性冠脈綜合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。然而,糖尿病患者冠狀動脈病變嚴(yán)重以及易損斑塊發(fā)生率高的機(jī)制尚未完全闡明,所以缺乏基于機(jī)制的治療措施。近年來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊外膜滋養(yǎng)血管(Vasa Vasorum,VV)常出現(xiàn),與斑塊穩(wěn)定性的變化有著密切關(guān)聯(lián);而炎癥又是糖尿病狀態(tài)下斑塊外膜滋養(yǎng)血管新生的核心驅(qū)動因素之一。脂肪組織的慢性低度炎癥作為2型糖尿病和動脈粥樣硬化的共同根源之一,已日益得到關(guān)注和認(rèn)可。但是功能失調(diào)的脂肪組織如何架起脂肪組織炎癥和斑塊外膜滋養(yǎng)血管病理性血管新生之間的橋梁,促進(jìn)易損斑塊的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。基于上述背景,針對炎癥的治療策略可能有一定的治療糖尿病動脈粥樣硬化的效果。CANTOS Ⅲ 期臨床研究證實(shí) Canakinumab(Canakinumab 是人 IL-1β的單克隆抗體)可以在降脂藥物治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低心肌梗死患者不良心血管事件的發(fā)生,為動脈粥樣硬化的炎癥假說首次提供了直接證據(jù)。但是,研究人員發(fā)現(xiàn)每1000名接受抗炎治療的患者中約有一人死于致命性感染。并且既往關(guān)于炎癥與動脈粥樣硬化心血管病之間的關(guān)系的臨床實(shí)驗(yàn),結(jié)果均為陰性。動脈粥樣硬化的抗炎治療仍然是有爭議的,并且預(yù)期效果不顯著。究其原因可能是現(xiàn)在的研究大多局限于分析單一炎癥因子的作用。因此,動脈粥樣硬化斑塊形成過程中細(xì)胞之間復(fù)雜信息的交流可能需要一個更加精確和多種致病因素整合的細(xì)胞間信息交流載體。近來研究發(fā)現(xiàn)exosomes因其攜帶多種核酸(mRNA、microRNA等)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等信號分子,在細(xì)胞間信息交流方面具有重要作用。與單一炎癥因子相比,exosomes能以更加有效的方式在細(xì)胞間傳遞信息。Exosomes上可攜帶不同的配體與不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合,因此具有特異的細(xì)胞靶向性。其功能主要取決于分泌細(xì)胞的類型和不同狀態(tài),不同細(xì)胞分泌的exosomes的組成成分不盡相同,因而能夠發(fā)揮不同的生物功能。脂肪細(xì)胞來源exosomes(Adipocyte-derived Exosomes,ADEs)其含有的蛋白表達(dá)譜、micrRNA譜和脂肪因子表達(dá)譜的含量多少與脂肪組織胰島素抵抗相關(guān)。而胰島素抵抗的ADEs(Insulin Resistance Adipocyte-derived Exosomes,IRADEs)可以通過引起機(jī)體炎癥參與胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展,并且具有多種生物學(xué)功能,如誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞成脂、免疫細(xì)胞的激活及血管新生等。另有報道,由脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose stromal cells,ADSCs)分泌的exosomes參與血管新生。但是IRADEs在動脈粥樣硬化VV血管新生中的作用尚未見報道。在涉及血管新生的信號家族中,刺猬蛋白(HH)家族作用顯著。HH是一種分子量19kDa的成形素,與受體細(xì)胞膜上的PTCH1受體結(jié)合后,解除對Smoothened(SMO)受體的抑制,激活轉(zhuǎn)錄因子 Gli1,Gli2 和 Gli3。Sonic hedgehog(SHH)是刺猬蛋白家族中表達(dá)最廣泛的,活性最高的分子。新近研究證實(shí)了 SHH可誘導(dǎo)胚胎組織血管新生,而且SHH特異性分布于成年動物血管外膜組織區(qū)域并且能通過激活周細(xì)胞維持成年人冠脈血管網(wǎng)完整性。SHH蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域組成:在氨基端的結(jié)構(gòu)域和在羧基端的結(jié)構(gòu)域,其中氨基端的結(jié)構(gòu)域具有SHH蛋白的信號活性,而羧基端的結(jié)構(gòu)域則具有自身蛋白水解酶活性及膽固醇轉(zhuǎn)移酶功能,在SHH自身修飾過程中發(fā)揮作用。SHH蛋白的脂質(zhì)修飾對于其信息傳遞至關(guān)重要。在細(xì)胞外親水性的環(huán)境中,exosomes作為疏水性的SHH蛋白天然載體,是調(diào)控SHH蛋白分布和遠(yuǎn)距離作用的重要機(jī)制之一。進(jìn)一步研究顯示,SHH蛋白修飾的CD34+骨髓細(xì)胞來源的exosomes會增加心肌病變的血管新生和改善心功能。另一方面,成熟的脂肪細(xì)胞能分泌產(chǎn)生SHH蛋白,并且在肥胖狀態(tài)下SHH的產(chǎn)生會增多。那么,IRADEs能否通過SHH信號蛋白促進(jìn)VV血管新生?在上述背景下,我們建立了胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型及2型糖尿病動脈粥樣硬化ApoE--小鼠模型,觀察IRADEs及其攜帶的SHH表達(dá)情況,以期探討IRADEs是否通過SHH蛋白參與了糖尿病動脈粥樣硬化斑塊VV血管新生,加重斑塊易損性。研究目的1.建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型,觀察IRADEs及其攜帶的SHH表達(dá)情況2.建立2型糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型,觀察IRADEs對斑塊VV血管新生、斑塊負(fù)荷和易損性的作用;3.IRADEs攜帶的SHH在VV血管新生、斑塊負(fù)荷和易損性中的作用。研究方法1.SHH蛋白沉默和過表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)RNAi干擾技術(shù)原則,設(shè)計(jì)3對針對小鼠SHH基因的siRNA,經(jīng)過篩選后,選擇沉默效率最高的序列構(gòu)建pAdxsi-GFP-SHH-shRNA腺病毒載體。根據(jù)小鼠SHH基因序列,設(shè)計(jì)合成引物,克隆小鼠SHH mRNA,PCR擴(kuò)增SHH基因,構(gòu)建含小鼠SHH基因的pShuttle-CMV-RED-SHH腺病毒過表達(dá)載體;2.胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立:應(yīng)用雞尾酒法(胰島素、地塞米松及3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤)將3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。然后,高糖(25mM)+高胰島素(10nM)刺激成熟的脂肪細(xì)胞24h,建立脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型;3.采用超速差速離心方法分離純化IRADEs;采用透射電鏡,nanosight和western blot等方法鑒定IRADEs;Exocet試劑盒定量不同脂肪細(xì)胞來源的IRADEs 數(shù)量;4.應(yīng)用PKH26熒光染料標(biāo)記IRADEs、鬼筆環(huán)肽標(biāo)記人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、CD31標(biāo)記小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)皮進(jìn)行體內(nèi)、體外示蹤實(shí)驗(yàn)研究IRADEs在體內(nèi)、體外的攝取情況;5.小鼠主動脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)不同處理的小鼠的胸主動脈環(huán),觀察IRADEs及SHH蛋白干預(yù)對小鼠胸主動脈環(huán)出芽數(shù)量的影響;6.通過Matrigel plug assay實(shí)驗(yàn),觀察IRADEs及SHH蛋白對血管新生的影響。蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色后基質(zhì)膠栓中的細(xì)胞數(shù)量和免疫組化CD31標(biāo)記新生血管陽性面積來定量血管新生情況;7.3周齡健康雄性ApoE-/-小鼠90只,禁食自由飲水12～16h后,進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)。注射劑量為1.5g/kg。后隨機(jī)分成兩組:普通飲食組和高糖高脂組(DM)。普通飲食組喂食普通小鼠維持飼料;高糖高脂飼料(34.5%脂肪,17.5%蛋白,48%碳水化合物)。在小鼠9周齡時,再次進(jìn)行IPGTT,對高糖高脂組中出現(xiàn)胰島素抵抗的小鼠進(jìn)行糖尿病造模:禁食自由飲水8～12h后,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)85mg/kg,普通飲食組給予STZ緩沖液腹腔注射。在小鼠11周齡時,測隨機(jī)血糖連續(xù)兩次≥11.lmmol/L且出現(xiàn)多飲多食多尿體重不減輕的小鼠為2型糖尿病造模成功小鼠。在小鼠16周齡時,普通飲食組小鼠隨機(jī)分為普通飲食組(Chow)、普通飲食IRADEs處理組(Chow+IRADEs)、普通飲食IRADEs敲減SHH組(Chow+IRADEssSHH-),糖尿病組小鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM)、糖尿病IRADEs處理組(DM+IRADEs)、糖尿病IRADEs敲減SHH組(DM+IRADEsSHH-)組,分別進(jìn)行尾靜脈注射對應(yīng)的IRADEs或IRADEs SHH-,每只小鼠每次注射IRADEs的絕對數(shù)量為l×l07個,每周打兩次,連續(xù)打8周,對照組(Chow、DM)組注射相同體積的PBS溶液;8.分別于ApoE-/-小鼠24周齡時進(jìn)行動脈超聲檢查,通過高分辨率顯微超聲技術(shù)測量主動脈弓、頭臂干和頸總動脈的內(nèi)中膜厚度(MT);9.對主動脈行大體油紅O染色,分析各組小鼠的斑塊負(fù)荷。主動脈根部連續(xù)切片分別行蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色、油紅O染色以及苦味酸-天狼猩紅特殊染色以觀察斑塊形態(tài),檢測主動脈根部斑塊橫斷面面積、斑塊內(nèi)的脂質(zhì)含量、膠原含量百分比。免疫組織化學(xué)染色檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌細(xì)胞(α-SMA)、滋養(yǎng)血管(Tomato lectin染色)、炎癥因子腫瘤壞死因子 α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素 1β(Interlukine1β,IL-1β)、白介素 6(Interlukine6,IL-6)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 A(vascularendothelial growthfactor A,VEGF-A)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和9(matrix metalloproteinase-2,MMP-9)的表達(dá)。采用以下公式計(jì)算斑塊易損指數(shù):斑塊易損指數(shù)=(脂質(zhì)含量百分比+巨噬細(xì)胞含量百分比)/(膠原含量百分比+平滑肌細(xì)胞含量百分比)。結(jié)果1.建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型為了產(chǎn)生與人類糖尿病動脈粥樣硬化疾病非常相似的非基因敲除糖尿病動物模型,單獨(dú)高糖高脂飲食6周后可誘導(dǎo)胰島素抵抗(Insulin Resistance IR),由腹腔注射糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)檢測小鼠糖耐量,然后聯(lián)合STZ一次性注射可導(dǎo)致輕微的血糖升高和IR(p0.05)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,DM小鼠仍然顯示升高的血糖,DM組平均體重明顯高于正常小鼠p0.05)。小鼠24周齡時,經(jīng)過IRADEs處理的小鼠糖耐量與對照組相比明顯降低(p0.05),而敲除IRADEs上SHH后小鼠糖耐量無明顯變化(p0.05)。2.建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型與0h相比,高糖高胰島素刺激分化成熟脂肪細(xì)胞24h后,脂肪細(xì)胞胰島素受體底物1蛋白水平基本不變,而胰島素受體底物1酪氨酸位點(diǎn)磷酸化顯著減少,絲氨酸位點(diǎn)(ser307)磷酸化顯著增多。說明高糖高胰島素刺激24后,脂肪細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗,表明我們成功構(gòu)建了脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。3.IRADEs的分離和鑒定透射電鏡以及免疫金標(biāo)技術(shù)顯示,IRADEs形態(tài)為呈現(xiàn)典型的杯狀結(jié)構(gòu),并且SHH蛋白存在于IRADEs表面。Western blot顯示,exosomes陽性指標(biāo)CD63、TSG101在我們提取的IRADEs中表達(dá),而陰性指標(biāo)Calnexin和Grp94不表達(dá),說明我們成功的從脂肪細(xì)胞上清中提取了純度較高的IRADEs。與正常ADEs相比,IRADEs上SHH蛋白表達(dá)增多,而在脂肪細(xì)胞過表達(dá)或者敲除SHH蛋白后,IRADEs上SHH蛋白表達(dá)會相應(yīng)增加或者減少。Exocet試劑盒測量exosomes數(shù)量,IRADEs 數(shù)量約為 7.5×109/ml。4.IRADEs能被人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和ApoE-/-小鼠斑塊攝取體外攝取實(shí)驗(yàn),用PKH26標(biāo)記IRADEs,在3h時候即可觀察到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞攝取IRADEs,延長IRADEs孵育時間,會發(fā)現(xiàn)更多IRADEs被內(nèi)皮細(xì)胞攝取,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中exosome增多。體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn),為研究斑塊是否攝取IRADEs,通過尾靜脈注射PKH26標(biāo)記的IRADEs進(jìn)入糖尿病ApoE-/-小鼠血液循環(huán),取主動脈根部斑塊,觀察到IRADEs能被斑塊內(nèi)皮細(xì)胞(CD31標(biāo)記)所攝取。5.離體水平IRADEs通過SHH蛋白促進(jìn)血管新生Matrigel plug assay實(shí)驗(yàn),通過統(tǒng)計(jì)HE染色血管新生的個數(shù)和免疫組化CD31陽性面積,結(jié)果顯示,VEGF組的細(xì)胞數(shù)量最多,Control組最少,IRADEs和IRADEssSHH+組比 IRADEssHH-組明顯增多,與 IRADEs 組比,IRADEsSHH+明顯比IRADEs組多(p0.05)。免疫組化CD31陽性面積的表達(dá)模式和組間差異與上述一致。此外,我們通過小鼠動脈環(huán)實(shí)驗(yàn)觀察了 IRADEs對血管新生的影響。VEGF組小鼠動脈環(huán)的出芽數(shù)量最多,對照組最少,IRADEs和IRADEsSHH+組比IRADEsSHH-明顯增多(p0.05),與 IRADEs 組比,IRADEsSHH+組明顯比 IRADEs組多(p0.05)。6.I RADEs通過SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠斑塊負(fù)荷:高分辨率小動物超聲檢測評估ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷。與對照組(Chow組)相比,DM組主動脈弓、頭臂干和頸動脈內(nèi)中膜厚度顯著增加(p0.05)。與DM組或者Chow組相比,DM+IRADEs或Chow+IRADEs組中ApoE-/-小鼠的主動脈弓、頭臂干和頸動脈內(nèi)中膜厚度顯著增加(p0.05),而敲除IRADEs上的SHH 信號蛋白后,DM+IRADEsSHH-或 Chow+ IRADEssSHH-組與 DM+IRADEs 或Chow+IRADEs組相比,主動脈弓、頭臂干和頸動脈內(nèi)中膜厚度明顯減少(p0.05)。組織病理學(xué)大體油紅O和主動脈根部斑塊橫切面HE染色進(jìn)一步證實(shí),與Chow組相比,DM組大體斑塊相對面積和橫斷面斑塊面積顯著增加(p0.05)與DM或Chow組相比,DM + IRADEs或Chow + IRADEs組的大體斑塊相對面積和橫斷面斑塊面積顯著增加(p0.05),DM + IRADEsSHH-或Chow + IRADEsSHH-組與DM + IRADEs或Chow + IRADEs組相比大體斑塊相對面積和橫斷面斑塊面積明顯降低(p0.05)。7。IRADEs通過SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊易損指數(shù)以及主動脈根部斑塊外膜滋養(yǎng)血管新生病理染色結(jié)果顯示,與其所對應(yīng)的對照組(即Chow和DM組)相比,IRADEs處理組主動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞含量百分比明顯增多,而敲減IRADEs上SHH蛋白后,斑塊內(nèi)脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞含量百分比明顯減少。說明IRADEs通過SHH蛋白能增加斑塊內(nèi)脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞百分比含量;與其所對應(yīng)的對照組(即Chow和DM組)相比,IRADEs處理組主動脈根部斑塊內(nèi)平滑肌及膠原含量百分比明顯減少,而敲減IRADEs上SHH蛋白后,斑塊內(nèi)平滑肌及膠原含量百分比明顯明顯增多。說明IRADEs通過SHH蛋白能減少平滑肌及膠原含量;根據(jù)公式計(jì)算各組斑塊易損指數(shù),與其所對應(yīng)的對照組(即Chow和DM組)相比,IRADEs處理組易損指數(shù)顯著增加,而敲減exosome上SHH蛋白后,斑塊易損指數(shù)明顯減少。說明IRADEs通過SHH蛋白能增加斑塊內(nèi)易損指數(shù)。我們檢測了小鼠斑塊血管外膜滋養(yǎng)血管新生情況。與Chow組相比,DM組中血管外膜滋養(yǎng)血管數(shù)量明顯增多。與DM組或者Chow組相比,DM+IRADEs或Chow+IRADEs組血管外膜滋養(yǎng)血管數(shù)量明顯增多(p0.05),而DM+IRADEsSHH-或 Chow+IRADEsSHH-組與 DM+IRADEs 或 Chow+IRADEs 組相比明顯減少(p0.05)。8.I RADEs通過SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊血管新生相關(guān)蛋白水平表達(dá)免疫組化及western blot結(jié)果顯示,與Chow組相比,DM組中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素 6(IL-6)、IL-1β、ICAM-1、血管新生因子 VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著增加。與DM或Chow組相比,DM + IRADEs或Chow+ IRADEs 顯著增加了 TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VEGF-A、MMP-2 和 MMP-9蛋白表達(dá)水平,而在 DM + IRADEsSHH-或 Chow + IRADEsSHH-組中 TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白水平表達(dá)顯著減少。結(jié)論1.胰島素抵抗的IRADEs上SHH蛋白表達(dá)增多,IRADEs能被人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和小鼠斑塊內(nèi)皮細(xì)胞攝取2.IRADEs顯著增加小鼠體內(nèi)Matrigel基質(zhì)膠栓和主動脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)的血管新生反應(yīng)3.IRADEs顯著增加斑塊VV血管新生,促進(jìn)斑塊血管新生相關(guān)因子的表達(dá),可能是其促進(jìn)2型糖尿病ApoE-/-小鼠斑塊負(fù)荷和易損性增加的重要機(jī)制,SHH蛋白介導(dǎo)了 IRADEs上述效應(yīng)研究背景脂肪組織被認(rèn)為是胰島素抵抗(Insulin Resistance IR)發(fā)生發(fā)展的主要部位之一。脂肪組織的生長和功能依賴于血管新生,所以脂肪組織血管新生是一個非常有希望治療肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的靶點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí),血管新生(Angiogenesis)可以通過調(diào)節(jié)脂肪形成和能量平衡來促進(jìn)或改善IR。脂肪組織由白色脂肪組織(White Adipose Tissue,WAT)和棕色脂肪組織(Brown Adipose Tissue,BAT)組成。以往的研究僅關(guān)注WAT或BAT血管新生對IR的作用。同一機(jī)體不同的脂肪組織血管新生在IR中的作用仍不清楚。脂肪組織血管新生與IR密切相關(guān)。WAT中的肥大的脂肪細(xì)胞可以分泌促血管新生因子,促進(jìn)血管新生,血管新生的增多會進(jìn)一步促進(jìn)脂肪細(xì)胞肥大,形成惡性循環(huán),加重IR。在代謝活動活躍的BAT中,血管新生可增加能量消耗并改善IR。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)——核激素受體超家族成員,在脂肪組織中高表達(dá)。PPARγ激動劑具有血管保護(hù)作用,能夠抑制動物模型和人類糖尿病的血管炎癥和動脈粥樣硬化進(jìn)展。重要的是,它們在體外和體內(nèi)具有調(diào)節(jié)血管新生的作用。PPARy存在于內(nèi)皮細(xì)胞中,多項(xiàng)研究表明激活PPARy可抑制體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖并分化為管狀結(jié)構(gòu)。其抗血管新生機(jī)制包括抑制Akt磷酸化,抑制VEGF受體-1(Flt-1)和2(Flk/KDR)、上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白受體CD36表達(dá)。CD36是一種涉及血管新生、動脈粥樣硬化、炎癥和脂質(zhì)代謝的B類清道夫受體。盡管CD36的配體凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin 1 TSP-1)可以通過非CD36依賴的途徑來抑制血管新生,但其主要的抗血管新生的作用仍然要依靠CD36信號通路。CD36的在大血管上較少表達(dá),在某些動脈上不表達(dá),主要在微血管上表達(dá)。PPARy能夠上調(diào)多種正常及腫瘤組織中CD36的表達(dá),是CD36表達(dá)的關(guān)鍵。已有文章證實(shí)PPARγ通過CD36誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡STAMP2是一種六次跨膜蛋白,屬于STAMP或STEAP家族。具有抗炎、維持正常葡萄糖耐量,脂質(zhì)代謝和改善IR等作用。有研究證實(shí),STAMP2基因缺陷小鼠在正常飲食條件下也會引起自發(fā)性代謝綜合征,胰島素抵抗,糖代謝紊亂,高血壓和脂肪肝等疾病。其不同部位的脂肪組織中STAMP2的缺乏程度不同,內(nèi)臟脂肪和棕色脂肪STAMP2的缺乏要比皮下脂肪顯著。最近的研究表明,STAMP2缺乏可引起脂肪組織中促血管新生因子的分泌增加,但是STAMP2在脂肪組織中對血管新生的影響及其機(jī)制尚不清楚。干擾STAMP2表達(dá)抑制脂肪形成是通過減少PPARγ的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。然而,STAMP2是否通過PPARγ/CD36信號通路調(diào)節(jié)脂肪組織的血管新生還有待進(jìn)一步研究。因此本研究提出如下假說,STAMP2通過PPARy/CD36信號通路參與調(diào)控了糖尿病脂肪組織中血管新生過程。為了研究STAMP2對糖尿病小鼠不同脂肪組織中血管新生的影響,我們建立了 2型糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠模型。研究STAMP2基因過表達(dá)對不同部位脂肪組織中血管新生的影響,并以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型研究STAMP2對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管型形成的作用及對PPARγ/CD36信號通路的影響。研究目的1.觀察糖尿病動物模型中STAMP2對脂肪組織血管新生的影響2.體外水平探討STAMP2對HUVECs遷移、管型形成以及血管新生相關(guān)因子表達(dá)的影響3.闡明STAMP2通過激活PPARγ/CD36信號通路調(diào)控血管新生研究方法1.動物實(shí)驗(yàn)部分:(1)建立2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠模型:3周齡健康雄性ApoE-/-LDLR-/-小鼠90只,禁食12～16h后,進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)。注射劑量為1.5mg/kg。后隨機(jī)分成兩組:普通飲食組和高糖高脂組(DM)。普通飲食組喂食普通小鼠維持飼料;高糖高脂飼料)。在小鼠9周齡時,再次進(jìn)行IPGTT,對高糖高脂組中出現(xiàn)胰島素抵抗的小鼠進(jìn)行糖尿病造模:禁食自由飲水8～12h后,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)85mg/kg,普通飲食組給予STZ緩沖液腹腔注射。在小鼠11周齡時,測隨機(jī)血糖連續(xù)兩次≥11.1mmol/L且出現(xiàn)多飲多食多尿體重不減輕的小鼠為2型糖尿病造模成功小鼠。各組以原飼料維續(xù)喂養(yǎng)。9周后分別經(jīng)尾靜脈注入腺病毒5×109PFU/只;各組繼續(xù)喂以原飼料4周。當(dāng)兩組小鼠20周齡時,將普食組隨機(jī)分為:普食+空載體組(Control+Vehicle)和普食+ STAMP2過表達(dá)組(Control +STAMP2),糖尿病組(DM)隨機(jī)分為:糖尿病+空載體組(DM+Vehicle)和糖尿病+STAMP2過表達(dá)組(DM+STAMP2),各組小鼠經(jīng)頸靜脈注射STAMP2過表達(dá)腺病毒或空載體腺病毒。兩周后,再次以相同劑量的通過頸靜脈將過表達(dá)腺病毒和空載體腺病毒注入小鼠體內(nèi)。在24周齡時處死小鼠,并保存附睪脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪;(2)小鼠體重的稱重:監(jiān)測小鼠體重的變化并記錄數(shù)據(jù);(3)小鼠生化指標(biāo)監(jiān)測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時心尖取血,分離膠促凝管離心后分別監(jiān)測空腹血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)的水平;(4)病理性檢測:對附睪、皮下及棕色脂肪組織分別進(jìn)行HE染色;通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測脂肪組織內(nèi)血管新生(標(biāo)記物為endomucin和CD31);(5)Western Blot檢測:提取新鮮的附睪、皮下及棕色脂肪組織并提取蛋白,觀察脂肪組織STAMP2、PPARy及CD36蛋白表達(dá)水平。2.主動脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)在Matrigel基質(zhì)膠中培養(yǎng)小鼠胸主動脈環(huán),觀察過表達(dá)STAMP2后對小鼠胸主動脈環(huán)出芽的影響。3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:(1)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)分為對照干擾組(siRNA-NC)、STAMP2 干擾組(siRNA-STAMP2)、STAMP2干擾+羅格列酮組(siRNA-STAMP2 + RSG)、空載體組(Ad-NC)、STAMP2過表達(dá)組(Ad-STAMP2)和 STAMP2 過表達(dá)+GW9662 組(Ad-STAMP2 +GW9662);(2)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)檢測:分別采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)來觀察STAMP2對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響(3)體外血管新生實(shí)驗(yàn):于含低生長因子基質(zhì)膠(Matrigel)中,觀察STAMP2對內(nèi)皮細(xì)胞體外血管新生的影響。(4)Western Blot 檢測I HUVECs 中 STAMP2、PPARγ 及 CD36 蛋白表達(dá)水平。(5)RT-PCR 檢測 STAMP2 對血管新生相關(guān)因子(VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1、Flt-1、CD36)mRNA 表達(dá)的影響。結(jié)果1。建立2型糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠模型(1)IPGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在3周齡時,普食組與糖尿病組ApoE-/-LDLR-/-小鼠的血糖水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);經(jīng)過6周高脂飲食后,與普食組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 15min、30min、60min 及120min血糖水平顯著增加,血糖曲線下面積顯著增加(p0.05);11周齡時,與對照組 ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 Omin、15min、30min、60min及120min血糖水平顯著增加,血糖曲線下面積顯著增加(p0.05);(2)與對照組ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠在9周齡、20周齡、22周齡及24周齡時體重顯著增加。2.STAMP2過表達(dá)改善了 2型糖尿病ApoE-/LDLR-/-小鼠糖耐量受損(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,與普食組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠及糖尿病+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR-/-小鼠體重均顯著增加(p0.05);糖尿病+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠與糖尿病+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR-/-小鼠體重?zé)o顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)IPGTT實(shí)驗(yàn)顯示,與糖尿病+空載體組ApoE--LDLR/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2 過表達(dá)組 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 Omin、15min、30min、60min 及 120min血糖水平顯著降低,血糖曲線下面積顯著降低(p0.05)。結(jié)果表明STAMP2的過表達(dá)提高了了糖尿病ApoE-/-LDLR-/-、鼠糖耐量,改善了胰島素抵抗。3.STAMP2過表達(dá)對2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠脂肪組織形態(tài)的影響與普食組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病組ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪與皮下脂肪細(xì)胞顯著增大,棕色脂肪組織存在脂質(zhì)空泡,有棕色脂肪白色變現(xiàn)象。與普食+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,普食+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR--小鼠附睪脂肪細(xì)胞顯著減小,皮下脂肪細(xì)胞大小無明顯差異,棕色脂肪組織脂質(zhì)空泡明顯減小,棕色脂肪白色變現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。與糖尿病+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2過表達(dá)組ApoE--LDLR-/-小鼠附睪脂肪細(xì)胞顯著減小,皮下脂肪細(xì)胞大小無顯著性差異,棕色脂肪組織中脂質(zhì)空泡顯著減小,逆轉(zhuǎn)棕色脂肪白色變現(xiàn)象。4.STAMP2過表達(dá)對2型糖尿病ApoE-/-LDL-/-小鼠脂肪組織血管新生的影響與普食組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪,皮下及棕色脂肪組織中血管新生顯著增加;與普食+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,在普食+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪與棕色脂肪組織中血管新生顯著降低。皮下脂肪組織中血管新生無顯著差異。與糖尿病+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪與棕色脂肪組織中血管新生顯著降低。皮下脂肪組織中血管新生無顯著差異。5.STAMP2過表達(dá)對2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠脂肪組織中PPARγ/CD36信號通路的影響與普食+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,PPARγ/CD36表達(dá)水平在普食+STAMP2過表達(dá)組ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪脂肪組織和棕色脂肪顯著升高。皮下脂肪中PPARγ/CD36表達(dá)水平無明顯變化。與糖尿病+空載體組ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,在糖尿病+STAMP2過表達(dá)組中,ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睪脂肪組織和棕色脂肪中PPARγ/CD36表達(dá)水平升高。皮下脂肪中PPARγ/CD36表達(dá)水平無明顯差異。6.STAMP2對主動脈環(huán)出芽能力的影響離體主動脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)表明,STAMP2過表達(dá)顯著抑制主動脈環(huán)出芽數(shù)量7.STAMP2對HUVECs遷移能力、體外成管能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與siRNA-NC組相比,siRNA-STAMP2組中遷移率顯著升高,這種作用被PPARγ激動劑RSG減弱;Ad-STAMP2組的細(xì)胞遷移率顯著低于Ad-NC組,這種作用被PPARyGW9662減弱。Transwell小室遷移進(jìn)一步證實(shí)了 STAMP2對HUVECs遷移的這種作用。與siRNA-NC組相比,siRNA-STAMP2組的細(xì)胞體外成管能力增強(qiáng),這種作用被RSG減弱;Ad-STAMP2組的細(xì)胞體外成管能力顯著低于Ad-NC組,這種作用被GW9662減弱。8.STAMP2對HUVECs中PPARγ/CD36信號通路及血管新生相關(guān)因子表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)STAMP2可以激活PPARγ/CD36信號通路,PPARγ/CD36蛋白表達(dá)水平顯著升高,這種效應(yīng)可以被PPARγ抑制劑GW9442削弱。干擾STAMP2基因表達(dá)后,PPARγ/CD36信號通路受抑制,PPARγ/CD36蛋白表達(dá)水平顯著降低,這種效應(yīng)可被PPARγ激動劑RSG所逆轉(zhuǎn)。RT-PCR結(jié)果顯示干擾STAMP2基因表達(dá)后,VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1表達(dá)增多,CD36表達(dá)減少,這種效應(yīng)可被PPARγ激動劑RSG所逆轉(zhuǎn);過表達(dá)STAMP2可以顯著抑制VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1表達(dá),增加CD36表達(dá),這種效應(yīng)可以被PPARγ抑制劑GW9442削弱。結(jié)論1.STAMP2可調(diào)控HUVECs遷移、成管、血管新生相關(guān)因子(VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1、CD36)的表達(dá)2.過表達(dá)STAMP2顯著減少糖尿病小鼠附睪脂肪和棕色脂肪的血管新生,相應(yīng)的附睪脂肪細(xì)胞顯著變小,棕色脂肪脂質(zhì)空泡顯著減少,提示過表達(dá)STAMP2可能通過減少脂肪組織血管新生改善脂肪組織代謝紊亂,這一過程是通過激活脂肪組織中PPAR γ/CD36信號通路實(shí)現(xiàn)的STAMP2通過PPARγ/CD36信號通路參與調(diào)控了糖尿病脂肪組織中血管新生過程。
【圖文】：

圖１邋Ａｐ0Ｅ＋小鼠糖尿病動脈粥樣硬化模型的建立逡逑（Ａ）邐３，９和１１周時不同組ＡｐｏＥ＿Ｍ、鼠糖耐量分析逡逑（Ｂ）邐３，９和１１周齡的ＡｐｏＥ＾小鼠的曲線下面積逡逑（Ｃ）在３，９，，１１，２０，２２和２４周齡時ＡｐｏＥ＿／＿小鼠的體重逡逑（Ｄ）邐２４周齡ＡｐｏＥ＿／＿小鼠的糖耐量分析。逡逑ｐ＜０．０５邋ｖｓ．邋Ｃｈｏｗ；邋＾＜０．０５邋ｖｓ．邋ＤＭ．逡逑６２逡逑

圖２脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立并且ＳＨＨ蛋白存在于丨ＲＡＤＥｓ上逡逑（Ａ）邐ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋檢測邋ＩＲＳ－１邋和邋ＩＲＳ－１邋磷酸化（Ｓｅｒ３０７）水平．＊ｐ＜０．０５邋ｖｓ．Ｏｈ邋組；逡逑（Ｂ）成熟的脂肪細(xì)胞油紅Ｏ染色；逡逑（Ｃ）免疫金標(biāo)電鏡圖（抗體為抗ＳＨＨ抗體）；逡逑（Ｄ）邐ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋檢測邋ＩＲＡＤＥｓ邋上邋ＳＨＨ邋表達(dá)情況逡逑＾Ｏ－ＯＳ邋ｖｓ．Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋＃ｐ＜０．０５邋ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑６３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陳文強(qiáng);張運(yùn);;動脈粥樣硬化易損斑塊的動物模型和檢測技術(shù)[J];中國動脈硬化雜志;2016年07期

2 楊永宗;;動脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究模型百年回溯[J];中國動脈硬化雜志;2008年12期

3 Leroyer A.S.;Isobe H.;Lesèche G.;C.M.Boulanger;韓瑞娟;;從人類動脈粥樣硬化斑塊中所分離出微粒的細(xì)胞起源和血栓形成活性[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(心臟病學(xué)分冊);2007年07期

本文編號：2597271