【摘要】：研究背景與目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種多病因的代謝疾病,以慢性高血糖為特點(diǎn),伴隨因胰島素(Insulin)分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是與胰島素抵抗、遺傳易感性等密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷,其主要病理表現(xiàn)是非酒精、病毒、藥物引起的肝臟脂肪含量增高。2型糖尿病是血脂代謝紊亂的一種常見疾病,而脂肪肝與脂代謝密不可分,所以2型糖尿病與脂肪肝也存在一定的聯(lián)系。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)病在2型糖尿病人群中非常普遍,大約有75%的2型糖尿病病人患有脂肪肝的臨床特征。而糖尿病在引起脂肪肝的病因中排第3位,僅次于飲酒與肥胖。糖尿病患者體內(nèi)的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用,脂蛋白合成也出現(xiàn)障礙,致使大多數(shù)葡萄糖和脂肪酸在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變成脂肪,沉積在肝內(nèi),導(dǎo)致脂肪肝。NAFLD亦可引起2型糖尿病,二者的合并存在,對(duì)患者造成嚴(yán)重的身體損害,對(duì)社會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此深入解析2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,具有深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。研究表明,過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)廣泛參與能量代謝的調(diào)控,PPARs有3個(gè)代表性成員:PPAR-α,PPAR-β/δ和PPAR-γ,它們?cè)谀芰看x中有著舉足輕重的作用,但它們的活性表達(dá)譜不同。PPAR-α分子具有促進(jìn)脂肪生成及分化、防止炎癥形成、維持葡萄糖的體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡、增加胰島素敏感性等作用,因此,PPAR-α與脂肪肝以及T2DM的發(fā)病機(jī)制之間具有相關(guān)性。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下在胞嘧啶分子C5位上添加一個(gè)具有活性的甲基團(tuán)變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的一種化學(xué)修飾方法。PPAR-α基因的甲基化是影響代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素,然而,目前尚不清楚其是否影響脂肪肝和T2DM的進(jìn)展。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高脂喂養(yǎng)的大鼠產(chǎn)生肥胖后,內(nèi)臟的毛細(xì)血管密度變小,血流量因此減少,脂肪細(xì)胞增生使得脂肪組織氧分壓降低,從而導(dǎo)致脂肪組織缺氧而產(chǎn)生壞死與炎性浸潤(rùn),浸潤(rùn)脂肪組織的巨噬細(xì)胞釋放過(guò)量的炎性介質(zhì),如IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1、CRP,從而引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)。目前尚不清楚這些炎癥因子在T2DM合并NAFLD中的水平。直至今日,尚沒有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)穩(wěn)定的2型糖尿病合并NAFLD的模型,本研究中,我們構(gòu)建2型糖尿病合并NAFLD大鼠動(dòng)物模型,在動(dòng)物模型中探索PPAR-αα基因甲基化在T2DM合并NAFLD動(dòng)物模型的構(gòu)建過(guò)程中是否發(fā)生變化,是否影響PPAR-αα蛋白的表達(dá),并分析其甲基化水平與炎癥因子IL-10、IL-6、TNF-α、TGF-β1和hs-CRP表達(dá)水平的相關(guān)性,并在臨床標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證分析。研究方法:(1)通過(guò)高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素(streptozptocin,STZ)喂養(yǎng)雄性SD大鼠構(gòu)建T2DM合并NAFLD的動(dòng)物模型,觀察其血脂指標(biāo)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),肝功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及血糖(Glu)、胰島素(INS)水平的變化,通過(guò)HE染色評(píng)價(jià)肝臟組織的脂肪變性。(2)取對(duì)照組和模型組動(dòng)物的尾靜脈全血,提取全血DNA,用DNA甲基化試劑盒測(cè)定PPAR-αα基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。抽提兩組動(dòng)物肝臟組織總RNA,用qPCR法分析其中PPAR-α基因mRNA水平的表達(dá)情況。對(duì)兩組動(dòng)物肝臟組織進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析PPAR-αα蛋白的表達(dá)。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)兩組動(dòng)物血清中炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-β1)、C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的含量。用蛋白質(zhì)免疫印跡法分析兩組動(dòng)物肝臟組織hs-CRP、TNF-αα、IL-6和TGF-β 1的蛋白表達(dá)量。(3)選32例正常(N組)和35例T2DM合并NAFLD患者(M組)作為受試者,清晨8:00空腹取靜脈血,生化檢測(cè)血清ALT、AST、TC、TG水平。用熒光定量PCR法檢測(cè)兩組受試者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β 1的表達(dá)水平。用ELISA方法分析兩組受試者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β 1蛋白表達(dá)量。用qPCR方法分析兩組血清PPAR-αα基因mRNA的表達(dá)水平。用ELISA方法分析兩組血清中PPAR-αα蛋白的表達(dá)水平。對(duì)兩組血清中PPAR-α的表達(dá)水平與炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-6,IL-10和TGF-β 1進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果:(1)高脂飼料加小劑量STZ(30mg/kg)喂養(yǎng)雄性SD大鼠兩周后,肝臟組織切片的HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠的肝細(xì)胞內(nèi)部有大小不一的脂滴存在,并且呈現(xiàn)出了小泡性的病理性脂變。糖耐量檢測(cè)結(jié)果異常。肝功能指標(biāo)ALT、AST與血脂指標(biāo)TC、TG水平均上升且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);且肝質(zhì)量以及肝指數(shù)水平進(jìn)一步提高且要高于對(duì)照組(P0.01)。這些研究結(jié)果表明T2DM合并NAFLD的大鼠模型構(gòu)建成功,可用于PPAR-α基因甲基化作用機(jī)制的研究。(2)對(duì)對(duì)照組和T2DM合并NAFLD模型組大鼠PPAR-α基因的甲基化程度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、模型組PPAR-α基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化陽(yáng)性率分別為10%和65%(P0.05)。模型組PPAR-α的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)較對(duì)照組均下降。與對(duì)照組比較,模型組hs-CRP、TNF-αα、TGF-β1和IL-6水平升高,IL-10的水平降低(P值均0.01)。(3)M組(T2DM合并NAFLD患者)受試者血清中ALT、AST、TC、TG和LDL水平較N組(正常)受試者顯著升高(P0.01),而HDL水平顯著降低(P0.01)。M組受試者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯高于N組受試者(P0.01),而IL-10表達(dá)則明顯低于N組受試者(P0.01)。M組受試者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯高于N組受試者(P0.01),而IL-10表達(dá)則明顯低于N組受試者(P0.01),與RNA水平檢測(cè)結(jié)果一致。M組受試者血清中PPAR-α基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。M組受試者血清中PPAR-α蛋白表達(dá)明顯低于N組受試者血清(P0.01)。結(jié)論:(1)通過(guò)病理和生化指標(biāo)的分析,我們首先證實(shí)了高脂飼料加小劑量STZ(30mg/kg)可以誘發(fā)并成功構(gòu)建與臨床2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝一致的穩(wěn)定大鼠動(dòng)物模型,為該疾病發(fā)生機(jī)制和治療方案的研究提供了工具。(2)T2DM合并NAFLD大鼠PPAR-α基因甲基化百分率明顯升高,血清炎性因子表達(dá)增多,可能是2型糖尿病脂肪肝發(fā)生率升高的機(jī)制之一。(3)T2DM合并NAFLD患者PPAR-α蛋白表達(dá)下調(diào),且患者的炎性因子表達(dá)異常較正常人群發(fā)生率高。在動(dòng)物模型和臨床血液標(biāo)本中均證實(shí),PPAR-αα基因的甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控與該疾病過(guò)程中的炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生密切相關(guān),提示我們PPAR-αα基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能是控制DM合并NAFLD疾病進(jìn)展的靶點(diǎn)之一。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑附圖表逡逑表２－１造模前后大鼠體重的比較（ｘ邋土ｓ）逡逑體重（ｇ）逡逑分組邐數(shù)量邐逡逑開始邐５周邐最后逡逑對(duì)照組邐２０邐１８９．４０±１４．２５邐２９５．邋０３±１２．４２邐３５９．６３±１３．５１逡逑模型組邐２０邐１９１．１２±１３＿３４邐３２７．４７±１１．６３＊邐３７６．３３±１４．５＊逡逑注：與對(duì)照組相比，Ｐ＜0．0５逡逑

圖２－２造模前后大鼠血清中血脂各指標(biāo)的變化情況逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ：對(duì)照組；Ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ：模型組；ＴＣ：總膽固醇；ＴＧ：甘油三醋；ＨＤＬ－Ｃ：逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1;R575.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 Veruska Cintia Alexandrino de Souza;Thiago Almeida Pereira;Valéria Wanderley Teixeira;Helotonio Carvalho;Maria Carolina Accioly Brelaz de Castro;Carolline Guimar?es D'assun??o;Andréia Ferreira de Barros;Camila Lima Carvalho;Virgínia Maria Barros de Lorena;Vláudia Maria Assis Costa;álvaro Aguiar Coelho Teixeira;Regina Celia Bressan Queiroz Figueiredo;Sheilla Andrade de Oliveira;;Bone marrow-derived monocyte infusion improves hepatic fibrosis by decreasing osteopontin,TGF-β1,IL-13 and oxidative stress[J];World Journal of Gastroenterology;2017年28期

2 Hyun Jung Lee;Jong Eun Yeon;Eun Jung Ko;Eileen L Yoon;Sang Jun Suh;Keunhee Kang;Hae Rim Kim;Seoung Hee Kang;Yang Jae Yoo;Jihye Je;Beom Jae Lee;Ji Hoon Kim;Yeon Seok Seo;Hyung Joon Yim;Kwan Soo Byun;;Peroxisome proliferator-activated receptor-delta agonist ameliorated inflammasome activation in nonalcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2015年45期

3 Ali Abdul-Hai;Ali Abdallah;Stephen DH Malnick;;Influence of gut bacteria on development and progression of non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Hepatology;2015年12期

4 Gábor Firneisz;;Non-alcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes mellitus: The liver disease of our age?[J];World Journal of Gastroenterology;2014年27期

5 Babu Krishnan;Shithu Babu;Jessica Walker;Adrian B Walker;Joseph M Pappachan;;Gastrointestinal complications of diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2013年03期

6 ;Prevalence of fatty liver disease and its risk factors in the population of South China[J];World Journal of Gastroenterology;2007年47期

，

本文編號(hào)：2596724