【摘要】：背景糖尿病腸道病變是1型糖尿病常見并發(fā)癥之一,常伴隨腹瀉等癥狀的發(fā)生,可能與腸動(dòng)力功能紊亂有關(guān),小腸平滑肌組織在維持腸道生理功能的過程中起到非常重要的作用,而Ca2+是介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞收縮的重要的“第二信使”。鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流(Store-operated Ca2+ entry,SOCE)是普遍存在的外鈣內(nèi)流機(jī)制,參與調(diào)節(jié)包括平滑肌細(xì)胞收縮在內(nèi)的多種生理功能,Orai1蛋白和基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)是鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流的主要組成成分,其中Orai1是位于細(xì)胞膜上的通道組成蛋白,STIM1是位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上單次跨膜蛋白,其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)側(cè)的EF手型結(jié)構(gòu)域能夠感受到鈣庫(kù)耗竭引起的Ca2+濃度降低,使其與膜上Orai1蛋白形成聚集斑,從而介導(dǎo)SOCE。機(jī)體內(nèi)持續(xù)高血糖會(huì)導(dǎo)致許多組織生理功能發(fā)生改變,因此,本研究試圖檢測(cè)1型糖尿病小腸平滑肌組織運(yùn)動(dòng)功能的改變及其與SOCE的關(guān)系。目的(1)觀察高糖培養(yǎng)對(duì)小鼠小腸平滑肌細(xì)胞株MUS-M1細(xì)胞SOCE的影響(2)研究Orai1和STIM1在1型糖尿病小鼠小腸平滑肌收縮和推進(jìn)功能中的作用方法1.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)量用高糖培養(yǎng)基與正常糖培養(yǎng)基培養(yǎng)MUS-M1細(xì)胞,分別通過激動(dòng)劑誘導(dǎo)引起內(nèi)鈣釋放,激活SOCE,利用鈣成像熒光顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。2.蛋白免疫印跡用Western Blot分別檢測(cè)STIM1與Orai1在正常糖與高糖培養(yǎng)的MUS-M1細(xì)胞中表達(dá)水平以及糖尿病小鼠小腸平滑肌組織STIM1、Orai1及BKca蛋白表達(dá)水平。3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA將特異性STIM1 siRNA、Orai1 siRNA分別轉(zhuǎn)染MUS-M1細(xì)胞,36 h后將細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.糖尿病模型的制備雄性小鼠,昆明種,5周齡,隨機(jī)分為注射STZ糖尿病組(DM)和對(duì)照組(Control), DM組按40 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)連續(xù)注射5天,制備糖尿病模型。正常組腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。14天后測(cè)空腹血糖≥11.1 mmol/L者為DM模型。5.離體腸管制備以及張力測(cè)定離體小腸迅速放進(jìn)Krebs溶液中等距分為等長(zhǎng)腸管(約1 cm),一端固定到浴槽底部,一端連接到張力換能器上,用BL-420數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)分析腸管收縮能力。6.小腸推進(jìn)功能用炭末半固體糊灌胃,測(cè)量標(biāo)記物距胃幽門的推進(jìn)距離占幽門到回腸末端長(zhǎng)度比值作為推進(jìn)功能標(biāo)準(zhǔn)。7.免疫共沉淀使用Orai1和BKCa抗體分別相互共沉淀,檢測(cè)糖尿病小鼠小腸平滑肌組織BKc。與Orai1蛋白相互作用強(qiáng)度的變化。結(jié)果(1)隨著高糖培養(yǎng)天數(shù)的增加,MUS-M1細(xì)胞SOCE程度逐漸增強(qiáng)；(2)高糖培養(yǎng)3天和7天的MUS-M1細(xì)胞,STIM1和Orai1蛋白表達(dá)水平顯著增高；(3)降低STIM1和Orai1蛋白的表達(dá)水平可降低正常糖以及高糖培養(yǎng)的MUS-M1細(xì)胞SOCE;(4)糖尿病小鼠較正常小鼠小腸平滑肌組織STIM1和Orai1蛋白表達(dá)水平顯著增高；(5)糖尿病導(dǎo)致SOCE介導(dǎo)的小鼠小腸平滑肌收縮強(qiáng)度增大,推進(jìn)速度加快；(6)特異性STIM1 siRNA以及Orai1 siRNA可降低由糖尿病引起的小鼠小腸平滑肌收縮強(qiáng)度及小腸推進(jìn)速度幅度；(7)小鼠小腸平滑肌組織Orai1與BKCa存在相互關(guān)系,糖尿病導(dǎo)致相互關(guān)系減弱。結(jié)論1.高糖刺激導(dǎo)致MUS-M1細(xì)胞Orai1和STIM1蛋白的表達(dá)升高,從而導(dǎo)致鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流增強(qiáng)。2.糖尿病小鼠小腸平滑肌細(xì)胞Orai1和STIM1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),從而使小腸收縮以及推進(jìn)速度加快。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1

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8 陸穎，

本文編號(hào)：2586857