【摘要】：研究背景：2型糖尿病是危害人類健康的常見(jiàn)慢性非傳染性疾病,在中醫(yī)學(xué)歸屬于“消渴”范疇,有“肺消”、“鬲消”等名稱。最新資料顯示,我國(guó)糖尿病患者超過(guò)1億,18歲以上糖尿病患病率高達(dá)11.6%,其中95%以上都是2型糖尿病。2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要由于胰島素抵抗和／或胰島素分泌不足引起。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的膜轉(zhuǎn)位障礙,是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要因素之一。GLUT4只有在細(xì)胞膜上才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的作用,這是葡萄糖代謝的限速步驟。骨骼肌、脂肪細(xì)胞膜上GLUT4的數(shù)量和活性,決定了機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取和利用,也決定了機(jī)體胰島素的敏感性。脂肪細(xì)胞攝取的葡萄糖總量雖然不及骨骼肌細(xì)胞,但是脂肪組織的對(duì)機(jī)體的胰島素敏感性特別重要。因?yàn)橹窘M織能緩沖過(guò)多的能量,脂肪細(xì)胞可以釋放許多脂肪因子調(diào)節(jié)能量代謝平衡,脂肪酸能干擾葡萄糖信號(hào)傳導(dǎo),脂肪酸氧化代謝受損可導(dǎo)致GLUT4的膜轉(zhuǎn)位障礙和胰島素抵抗。祖國(guó)醫(yī)學(xué)從肝火、痰濁、瘀血、內(nèi)毒、脾虛等不同角度采用疏肝清熱、瀉火解毒、活血化瘀、健脾化痰等方法,來(lái)改善胰島素抵抗取得了較好的療效。中藥重在整體調(diào)節(jié),中藥復(fù)方則通過(guò)多環(huán)節(jié)、多途徑來(lái)改善機(jī)體胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),與降低血糖、調(diào)整血脂、糾正代謝紊亂等綜合干預(yù)的治療原則相符。研究表明,小檗堿具有改善胰島素抵抗、降低血糖、糾正脂質(zhì)紊亂和胰島素增敏作用,且無(wú)明顯增加體重和水潴留等不良反應(yīng),而甘丙肽能增加動(dòng)物的攝食而導(dǎo)致肥胖。我們過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射甘丙肽受體拮抗劑M35能夠顯著降低健康及2型糖尿病大鼠胰島素的敏感性,減少脂肪和肌肉組織對(duì)葡萄糖的攝取與利用,提示內(nèi)源性甘丙肽通過(guò)作用外周胰島素敏感組織上的受體,增加胰島素的敏感性,降低胰島素抵抗。然而,目前尚不清楚中樞甘丙肽能否調(diào)節(jié)胰島素敏感性,以及小檗堿能否協(xié)同甘丙肽而達(dá)到增強(qiáng)胰島素敏感性的效應(yīng)。本研究運(yùn)用2型糖尿病鼠模型,探討中樞甘丙肽對(duì)脂肪組織胰島素敏感性影響,以及小檗堿分別與甘丙肽、2型甘丙肽亞型受體(GALR2)特異性激動(dòng)劑和拮抗劑聯(lián)用導(dǎo)致的緩解胰島素抵抗的效應(yīng),從而了解小檗堿能否協(xié)同甘丙肽降低脂肪組織胰島素抵抗及其信號(hào)通路,加深對(duì)小檗堿改善2型糖尿病鼠胰島素抵抗機(jī)制的認(rèn)識(shí),為聯(lián)用小檗堿與無(wú)增重效應(yīng)的GALR2激動(dòng)劑,以達(dá)到更好的降低胰島素抵抗療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),有重要的理論和臨床意義。研究目的：了解中樞甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用,判斷小檗堿能否協(xié)同甘丙肽以及GALR2激動(dòng)劑降低2型糖尿病鼠脂肪組織胰島素抵抗及其信號(hào)通路。研究方法：1、為了解中樞甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用,本研究將跑臺(tái)訓(xùn)練作為促進(jìn)大鼠內(nèi)源性甘丙肽分泌的生理刺激,側(cè)腦室注射甘丙肽特異拮抗劑M35以阻斷中樞甘丙肽的作用。觀察在阻斷內(nèi)源性甘丙肽的條件下,糖尿病安靜M35組和糖尿病運(yùn)動(dòng)M35組大鼠相對(duì)于糖尿病安靜對(duì)照和糖尿病運(yùn)動(dòng)對(duì)照,在正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中葡萄糖的滴注速率和脫氧葡萄糖2DG含量變化；ELISA法檢測(cè)血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇濃度的改變；應(yīng)用Western blot法測(cè)定脂肪細(xì)胞內(nèi)外膜GLUT4蛋白含量和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)下丘腦中GAL mRNA表達(dá)的改變,依此推斷內(nèi)源性GAL在調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗過(guò)程中的作用。2、為了判斷小檗堿能否協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗及其信號(hào)通路,實(shí)驗(yàn)大鼠分別單獨(dú)及聯(lián)合給予小檗堿、甘丙肽和Akt抑制劑MK-2206。通過(guò)比較糖尿病小檗堿+甘丙肽組大鼠相對(duì)于糖尿病小檗堿對(duì)照和糖尿病甘丙肽對(duì)照脂肪細(xì)胞脫氧葡萄糖2DG的變化,用Real-time PCR技術(shù)測(cè)定脂肪細(xì)胞中GLUT4 mRNA表達(dá)水平以及應(yīng)用Western blot法測(cè)定脂肪細(xì)胞膜3LUT4和囊泡相關(guān)性膜蛋白2(VAMP2)蛋白濃度的改變,從而推斷聯(lián)合運(yùn)用小檗堿和甘丙肽比單獨(dú)運(yùn)用這兩種藥物中的任何一種是否能進(jìn)一步提高胰島素敏感性；此外,應(yīng)用Western blot法測(cè)定脂肪細(xì)胞膜Akt、pAkt、pAkt2Thr308、 pAkt2Ser473、pAS160Thr462、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(pFoxO1)、糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β)含量,用Real-time PCR技術(shù)測(cè)定脂肪細(xì)胞中Akt2 mRNA的表達(dá)水平,從而了解聯(lián)合運(yùn)用小檗堿和甘丙肽比單獨(dú)運(yùn)用這兩種藥物中的任何一種,對(duì)Akt以及其下游信號(hào)蛋白磷酸化的影響,從而推斷Akt信號(hào)通路是否參與了小檗堿協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗的過(guò)程。3、為了判斷小檗堿能否協(xié)同GALR2激動(dòng)劑降低2型糖尿病小鼠脂肪組織胰島素抵抗,實(shí)驗(yàn)糖尿病小鼠分別給予小檗堿、GALR2激動(dòng)劑M1896及GALR2拮抗劑M871,對(duì)照小鼠給予生理鹽水。記錄小鼠進(jìn)食量和實(shí)驗(yàn)前后稱體重；用快速血糖儀測(cè)定空腹血糖；糖耐量試驗(yàn)了解小鼠胰島素敏感性；ELISA法測(cè)定血漿胰島素、C反應(yīng)蛋白、脂聯(lián)素、甘丙肽、瘦素濃度；Western blot法了解脂肪細(xì)胞GLUT4含量與膜轉(zhuǎn)位的蛋白水平：Real-TimePCR法檢測(cè)脂肪組織中GLUT4 mRNA的含量。比較糖尿病小檗堿+激動(dòng)劑組小鼠相對(duì)于糖尿病小檗堿對(duì)照和糖尿病激動(dòng)劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)前后稱體重和血糖的改變,胰島素敏感性指標(biāo)的變化,據(jù)此判斷小檗堿能否協(xié)同GALR2激動(dòng)劑降低2型糖尿病小鼠脂肪組織胰島素抵抗,同時(shí)不影響動(dòng)物的進(jìn)食量和體重。研究結(jié)果：1、運(yùn)動(dòng)能夠顯著誘導(dǎo)健康及2型糖尿病大鼠中樞GALmRNA表達(dá)；中樞注射M35后,大鼠體重顯著下降,血糖顯著升高,葡萄糖輸注速率和2-DG水平顯著下降,胰島素分泌顯著升高,膽固醇和甘油三酯水平顯著升高。脂肪細(xì)胞GLUT4蛋白總量顯著降低,GLUT4由細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞外膜的轉(zhuǎn)位量顯著減少。2、聯(lián)合給予小檗堿和甘丙肽大鼠的脂肪細(xì)胞2-DG濃度、GLUT4總量、細(xì)胞外膜GLUT4和VAMP2濃度顯著高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,而脂肪細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)水平以及脂肪細(xì)胞內(nèi)膜GLUT4含量均無(wú)顯著改變。另外,小檗堿+甘丙肽組大鼠脂肪細(xì)胞中pAkt2Thr308和pAkt2Ser473表達(dá)水平、pAkt/Akt比率以及Akt2 mRNA表達(dá)水平顯著高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組。在Akt2的下游蛋白中,小檗堿+甘丙肽組大鼠脂肪細(xì)胞的pAS160Thr462表達(dá)水平高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,而FoxO1和GSK-3p的表達(dá)顯著低于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組。Akt抑制劑MK-2206能有效拮抗小檗堿協(xié)同GAL引致的上述改變。3、糖尿病小鼠中樞運(yùn)用GALR2激動(dòng)劑后,胰島素和CRP分泌以及血糖水平顯著降低,脂聯(lián)素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率增加,胰島素抵抗降低,脂肪細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)及GLUT4蛋白總量顯著增加,GLUT4由細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞外膜的轉(zhuǎn)位顯著增加,且無(wú)增加攝食量和體重效應(yīng)。相對(duì)于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,小檗堿與GALR2激動(dòng)劑聯(lián)用后,糖尿病小鼠攝食量和體重顯著減少,血糖顯著降低,脂聯(lián)素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率顯著增加,CRP分泌和胰島素抵抗顯著下降,脂肪細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)及GLUT4蛋白總量顯著增加,GLUT4由細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞外膜的轉(zhuǎn)位顯著增加。結(jié)論：1、中樞注射M35使糖尿病大鼠脂肪細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位和攝取葡萄糖的能力下降,胰島素抵抗增強(qiáng)。提示內(nèi)源性甘丙肽具有促進(jìn)GLUT4數(shù)量增多和膜轉(zhuǎn)位的功能,甘丙肽是促進(jìn)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要激素之一。沒(méi)有甘丙肽作用,胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的功能下降,甘丙肽是維持機(jī)體血糖平衡的不可缺少的重要因素。2、小檗堿能通過(guò)Akt2信號(hào)蛋白途徑增強(qiáng)甘丙肽緩解胰島素抵抗的作用,但是小檗堿不能進(jìn)一步提高脂肪細(xì)胞的甘丙肽總量。用抑制劑MK-2206阻斷Akt的作用后,小檗堿不能進(jìn)一步提高甘丙肽改善胰島素抵抗的作用。因此,小檗堿增強(qiáng)甘丙肽緩解胰島素抵抗的作用具有Akt依賴性。3、小檗堿與GalR2激動(dòng)劑聯(lián)用相比較于單獨(dú)使用小檗堿或GALR2激動(dòng)劑,能顯著提高糖尿病小鼠胰島素敏感性。由于激活GALR2無(wú)甘丙肽誘導(dǎo)出現(xiàn)的增加體重的效應(yīng),因此,聯(lián)用小檗堿與GALR2激動(dòng)劑提供了一個(gè)不增加體重而又可有效防治胰島素抵抗的新途徑,為治療胰島素抵抗和2型糖尿病提供了新思路。
【圖文】：

＊＊邋戶邋＜０．０１邋ｖｓ．邋ＤＢＧ．逡逑２．６各沮大鼠脂肪細(xì)胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ水平比率逡逑表２－６和圖２－６濕示，與糖尿病對(duì)照組比較，，糖尿病小柴堿組和糖尿病甘丙化組脂肪逡逑細(xì)胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比率提氋（ｆ邋＜０．０１，戶＜０．０５）。小窠堿可Ｗ增強(qiáng)甘丙化提高脂肪細(xì)胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ逡逑水平比率的作用，小蔡堿＋甘丙膚組細(xì)胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比率高于糖尿病甘丙膚組（？＜０．０５，邋？逡逑

１各組小鼠體重變化逡逑ｅ３－１．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑驗(yàn)前比較（b6＜０．０５）；邋＃與實(shí)驗(yàn)后糖尿病對(duì)照組比較（Ｐ＜0．0５）。逡逑組小鼠攝食量逡逑表３－２可看出，糖尿病對(duì)照組小鼠攝食量高于健康對(duì)照組（ｆ＜0．0５）。糖組、糖尿病Ｍ１８９６組小鼠攝食量與糖尿病對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ｆ＞0．小柴堿組小鼠攝食量低于糖尿病對(duì)照組（戶＜０．０５）。糖尿病小窠堿＋Ｍ１８％低于糖尿病Ｍ１８９６組（Ｐ＜０．０５）。糖尿病小窠堿＋Ｍ８７１組小鼠攝食量低于６邋組（ｆ＜０．０５）。逡逑－２各組小鼠攝食量變化（ｇ／ｄ）逡逑ｌｅ邋３－２．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｆｏｏｄ邋ｉｎｔａｋｅ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒｏ叩Ｓ邋（ｇ／ｄ）逡逑組別邐例數(shù)邐－逡逑Ｘ±ｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2582411