【摘要】：研究背景：2型糖尿病是危害人類健康的常見慢性非傳染性疾病,在中醫(yī)學歸屬于“消渴”范疇,有“肺消”、“鬲消”等名稱。最新資料顯示,我國糖尿病患者超過1億,18歲以上糖尿病患病率高達11.6%,其中95%以上都是2型糖尿病。2型糖尿病發(fā)病機制復雜,主要由于胰島素抵抗和／或胰島素分泌不足引起。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)的膜轉(zhuǎn)位障礙,是導致胰島素抵抗的重要因素之一。GLUT4只有在細胞膜上才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運葡萄糖進入細胞的作用,這是葡萄糖代謝的限速步驟。骨骼肌、脂肪細胞膜上GLUT4的數(shù)量和活性,決定了機體對葡萄糖的攝取和利用,也決定了機體胰島素的敏感性。脂肪細胞攝取的葡萄糖總量雖然不及骨骼肌細胞,但是脂肪組織的對機體的胰島素敏感性特別重要。因為脂肪組織能緩沖過多的能量,脂肪細胞可以釋放許多脂肪因子調(diào)節(jié)能量代謝平衡,脂肪酸能干擾葡萄糖信號傳導,脂肪酸氧化代謝受損可導致GLUT4的膜轉(zhuǎn)位障礙和胰島素抵抗。祖國醫(yī)學從肝火、痰濁、瘀血、內(nèi)毒、脾虛等不同角度采用疏肝清熱、瀉火解毒、活血化瘀、健脾化痰等方法,來改善胰島素抵抗取得了較好的療效。中藥重在整體調(diào)節(jié),中藥復方則通過多環(huán)節(jié)、多途徑來改善機體胰島素抵抗狀態(tài),與降低血糖、調(diào)整血脂、糾正代謝紊亂等綜合干預的治療原則相符。研究表明,小檗堿具有改善胰島素抵抗、降低血糖、糾正脂質(zhì)紊亂和胰島素增敏作用,且無明顯增加體重和水潴留等不良反應(yīng),而甘丙肽能增加動物的攝食而導致肥胖。我們過去的研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射甘丙肽受體拮抗劑M35能夠顯著降低健康及2型糖尿病大鼠胰島素的敏感性,減少脂肪和肌肉組織對葡萄糖的攝取與利用,提示內(nèi)源性甘丙肽通過作用外周胰島素敏感組織上的受體,增加胰島素的敏感性,降低胰島素抵抗。然而,目前尚不清楚中樞甘丙肽能否調(diào)節(jié)胰島素敏感性,以及小檗堿能否協(xié)同甘丙肽而達到增強胰島素敏感性的效應(yīng)。本研究運用2型糖尿病鼠模型,探討中樞甘丙肽對脂肪組織胰島素敏感性影響,以及小檗堿分別與甘丙肽、2型甘丙肽亞型受體(GALR2)特異性激動劑和拮抗劑聯(lián)用導致的緩解胰島素抵抗的效應(yīng),從而了解小檗堿能否協(xié)同甘丙肽降低脂肪組織胰島素抵抗及其信號通路,加深對小檗堿改善2型糖尿病鼠胰島素抵抗機制的認識,為聯(lián)用小檗堿與無增重效應(yīng)的GALR2激動劑,以達到更好的降低胰島素抵抗療效提供實驗依據(jù),有重要的理論和臨床意義。研究目的：了解中樞甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪細胞胰島素抵抗的作用,判斷小檗堿能否協(xié)同甘丙肽以及GALR2激動劑降低2型糖尿病鼠脂肪組織胰島素抵抗及其信號通路。研究方法：1、為了解中樞甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪細胞胰島素抵抗的作用,本研究將跑臺訓練作為促進大鼠內(nèi)源性甘丙肽分泌的生理刺激,側(cè)腦室注射甘丙肽特異拮抗劑M35以阻斷中樞甘丙肽的作用。觀察在阻斷內(nèi)源性甘丙肽的條件下,糖尿病安靜M35組和糖尿病運動M35組大鼠相對于糖尿病安靜對照和糖尿病運動對照,在正葡萄糖鉗夾實驗中葡萄糖的滴注速率和脫氧葡萄糖2DG含量變化；ELISA法檢測血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇濃度的改變；應(yīng)用Western blot法測定脂肪細胞內(nèi)外膜GLUT4蛋白含量和Real-timePCR技術(shù)檢測下丘腦中GAL mRNA表達的改變,依此推斷內(nèi)源性GAL在調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗過程中的作用。2、為了判斷小檗堿能否協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗及其信號通路,實驗大鼠分別單獨及聯(lián)合給予小檗堿、甘丙肽和Akt抑制劑MK-2206。通過比較糖尿病小檗堿+甘丙肽組大鼠相對于糖尿病小檗堿對照和糖尿病甘丙肽對照脂肪細胞脫氧葡萄糖2DG的變化,用Real-time PCR技術(shù)測定脂肪細胞中GLUT4 mRNA表達水平以及應(yīng)用Western blot法測定脂肪細胞膜3LUT4和囊泡相關(guān)性膜蛋白2(VAMP2)蛋白濃度的改變,從而推斷聯(lián)合運用小檗堿和甘丙肽比單獨運用這兩種藥物中的任何一種是否能進一步提高胰島素敏感性；此外,應(yīng)用Western blot法測定脂肪細胞膜Akt、pAkt、pAkt2Thr308、 pAkt2Ser473、pAS160Thr462、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(pFoxO1)、糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β)含量,用Real-time PCR技術(shù)測定脂肪細胞中Akt2 mRNA的表達水平,從而了解聯(lián)合運用小檗堿和甘丙肽比單獨運用這兩種藥物中的任何一種,對Akt以及其下游信號蛋白磷酸化的影響,從而推斷Akt信號通路是否參與了小檗堿協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪組織胰島素抵抗的過程。3、為了判斷小檗堿能否協(xié)同GALR2激動劑降低2型糖尿病小鼠脂肪組織胰島素抵抗,實驗糖尿病小鼠分別給予小檗堿、GALR2激動劑M1896及GALR2拮抗劑M871,對照小鼠給予生理鹽水。記錄小鼠進食量和實驗前后稱體重；用快速血糖儀測定空腹血糖；糖耐量試驗了解小鼠胰島素敏感性；ELISA法測定血漿胰島素、C反應(yīng)蛋白、脂聯(lián)素、甘丙肽、瘦素濃度；Western blot法了解脂肪細胞GLUT4含量與膜轉(zhuǎn)位的蛋白水平：Real-TimePCR法檢測脂肪組織中GLUT4 mRNA的含量。比較糖尿病小檗堿+激動劑組小鼠相對于糖尿病小檗堿對照和糖尿病激動劑對照實驗前后稱體重和血糖的改變,胰島素敏感性指標的變化,據(jù)此判斷小檗堿能否協(xié)同GALR2激動劑降低2型糖尿病小鼠脂肪組織胰島素抵抗,同時不影響動物的進食量和體重。研究結(jié)果：1、運動能夠顯著誘導健康及2型糖尿病大鼠中樞GALmRNA表達；中樞注射M35后,大鼠體重顯著下降,血糖顯著升高,葡萄糖輸注速率和2-DG水平顯著下降,胰島素分泌顯著升高,膽固醇和甘油三酯水平顯著升高。脂肪細胞GLUT4蛋白總量顯著降低,GLUT4由細胞內(nèi)膜向細胞外膜的轉(zhuǎn)位量顯著減少。2、聯(lián)合給予小檗堿和甘丙肽大鼠的脂肪細胞2-DG濃度、GLUT4總量、細胞外膜GLUT4和VAMP2濃度顯著高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,而脂肪細胞GLUT4 mRNA表達水平以及脂肪細胞內(nèi)膜GLUT4含量均無顯著改變。另外,小檗堿+甘丙肽組大鼠脂肪細胞中pAkt2Thr308和pAkt2Ser473表達水平、pAkt/Akt比率以及Akt2 mRNA表達水平顯著高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組。在Akt2的下游蛋白中,小檗堿+甘丙肽組大鼠脂肪細胞的pAS160Thr462表達水平高于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,而FoxO1和GSK-3p的表達顯著低于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組。Akt抑制劑MK-2206能有效拮抗小檗堿協(xié)同GAL引致的上述改變。3、糖尿病小鼠中樞運用GALR2激動劑后,胰島素和CRP分泌以及血糖水平顯著降低,脂聯(lián)素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率增加,胰島素抵抗降低,脂肪細胞GLUT4mRNA表達及GLUT4蛋白總量顯著增加,GLUT4由細胞內(nèi)膜向細胞外膜的轉(zhuǎn)位顯著增加,且無增加攝食量和體重效應(yīng)。相對于糖尿病甘丙肽組和糖尿病小檗堿組,小檗堿與GALR2激動劑聯(lián)用后,糖尿病小鼠攝食量和體重顯著減少,血糖顯著降低,脂聯(lián)素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率顯著增加,CRP分泌和胰島素抵抗顯著下降,脂肪細胞GLUT4mRNA表達及GLUT4蛋白總量顯著增加,GLUT4由細胞內(nèi)膜向細胞外膜的轉(zhuǎn)位顯著增加。結(jié)論：1、中樞注射M35使糖尿病大鼠脂肪細胞GLUT4的轉(zhuǎn)位和攝取葡萄糖的能力下降,胰島素抵抗增強。提示內(nèi)源性甘丙肽具有促進GLUT4數(shù)量增多和膜轉(zhuǎn)位的功能,甘丙肽是促進葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的重要激素之一。沒有甘丙肽作用,胰島素促進葡萄糖攝取的功能下降,甘丙肽是維持機體血糖平衡的不可缺少的重要因素。2、小檗堿能通過Akt2信號蛋白途徑增強甘丙肽緩解胰島素抵抗的作用,但是小檗堿不能進一步提高脂肪細胞的甘丙肽總量。用抑制劑MK-2206阻斷Akt的作用后,小檗堿不能進一步提高甘丙肽改善胰島素抵抗的作用。因此,小檗堿增強甘丙肽緩解胰島素抵抗的作用具有Akt依賴性。3、小檗堿與GalR2激動劑聯(lián)用相比較于單獨使用小檗堿或GALR2激動劑,能顯著提高糖尿病小鼠胰島素敏感性。由于激活GALR2無甘丙肽誘導出現(xiàn)的增加體重的效應(yīng),因此,聯(lián)用小檗堿與GALR2激動劑提供了一個不增加體重而又可有效防治胰島素抵抗的新途徑,為治療胰島素抵抗和2型糖尿病提供了新思路。
【圖文】：

＊＊邋戶邋＜０．０１邋ｖｓ．邋ＤＢＧ．逡逑２．６各沮大鼠脂肪細胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ水平比率逡逑表２－６和圖２－６濕示，與糖尿病對照組比較，，糖尿病小柴堿組和糖尿病甘丙化組脂肪逡逑細胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比率提氋（ｆ邋＜０．０１，戶＜０．０５）。小窠堿可Ｗ增強甘丙化提高脂肪細胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ逡逑水平比率的作用，小蔡堿＋甘丙膚組細胞ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比率高于糖尿病甘丙膚組（？＜０．０５，邋？逡逑

１各組小鼠體重變化逡逑ｅ３－１．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑驗前比較（b6＜０．０５）；邋＃與實驗后糖尿病對照組比較（Ｐ＜0．0５）。逡逑組小鼠攝食量逡逑表３－２可看出，糖尿病對照組小鼠攝食量高于健康對照組（ｆ＜0．0５）。糖組、糖尿病Ｍ１８９６組小鼠攝食量與糖尿病對照組比較，無統(tǒng)計學差異（ｆ＞0．小柴堿組小鼠攝食量低于糖尿病對照組（戶＜０．０５）。糖尿病小窠堿＋Ｍ１８％低于糖尿�。停保福梗督M（Ｐ＜０．０５）。糖尿病小窠堿＋Ｍ８７１組小鼠攝食量低于６邋組（ｆ＜０．０５）。逡逑－２各組小鼠攝食量變化（ｇ／ｄ）逡逑ｌｅ邋３－２．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｆｏｏｄ邋ｉｎｔａｋｅ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒｏ叩Ｓ邋（ｇ／ｄ）逡逑組別邐例數(shù)邐－逡逑Ｘ±ｓ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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