本文關(guān)鍵詞：AMPK對高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞connexin43下調(diào)及早衰的調(diào)控機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的:系膜細(xì)胞肥大及衰老標(biāo)志物表達(dá)增高是糖尿病腎病早期病理特征。已有研究證實Cx43在高糖導(dǎo)致的系膜細(xì)胞衰老過程起著重要作用，，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確。在細(xì)胞內(nèi)的信號網(wǎng)絡(luò)中，AMPK/mTOR信號通路參與系膜細(xì)胞肥大與衰老過程的調(diào)控。本實驗觀察了在糖尿病腎病腎臟組織與相對正常腎臟組織中p-AMPK、細(xì)胞間隙連接蛋白connexin43及衰老相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白p21的表達(dá)區(qū)別，研究高糖培養(yǎng)條件下系膜細(xì)胞衰老相關(guān)表型、細(xì)胞間隙連接蛋白Cx43及AMPK/mTOR信號通路的變化,并探討它們之間的相互關(guān)系。 方法:收集病理診斷為糖尿病腎病的腎組織標(biāo)本及腎切除手術(shù)中相對正常的腎組織標(biāo)本，組織免疫熒光技術(shù)檢測Cx43,p-AMPK及p21在糖腎及正常腎組織中的表達(dá)及分布。分離培養(yǎng)3月齡SD大鼠腎小球系膜細(xì)胞并鑒定,分為以下幾組:正常糖組(5.5mM葡萄糖)、高糖組(30mM葡萄糖)、滲透壓對照組(5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇)、正常糖+AMPK抑制劑組、高糖+AMPK激活劑組、高糖+mTOR抑制劑組、高糖+mTOR抑制劑+AMPK抑制劑組。Western Blot檢測connexin43、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21、p27的表達(dá)水平及各組AMPK/mTOR信號通路的改變，細(xì)胞免疫熒光觀察Cx43及AMPK的表達(dá)變化。檢測各組細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率,應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增值能力及細(xì)胞周期變化。應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)從基因水平抑制AMPK的表達(dá)，研究抑制AMPK對系膜細(xì)胞Cx43表達(dá)的調(diào)控作用和衰老表型的影響。 結(jié)果:組織免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Cx43在糖腎冰凍切片中的表達(dá)明顯少于正常腎組織，同時AMPK的活性受到抑制，而細(xì)胞衰老相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白p21的表達(dá)明顯增高。高糖刺激使系膜細(xì)胞AMPK的活性受到抑制而mTOR被激活（P＜0.05），同時connexin43表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞出現(xiàn)增殖能力下降，G0/G1期延長，伴隨著細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21、p27的表達(dá)水平升高，SA-β-gal陽性率較對照組顯著升高（P＜0.05）。正常糖時，通過siRNA-AMPK抑制AMPK的活性，減輕AMPK對mTOR的抑制作用，可以模擬高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞Cx43表達(dá)的下調(diào)及衰老表型。高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞時通過二甲雙胍激活A(yù)MPK或雷帕霉素抑制mTOR的活性，可以恢復(fù)Cx43的表達(dá)并改善高糖誘導(dǎo)的衰老表型。而在雷帕霉素干預(yù)高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞同時，抑制AMPK的活性，會加重細(xì)胞的衰老表型及減少connexin43的表達(dá)，可見AMPK對衰老表型及Cx43的調(diào)控存在除mTOR外的其他調(diào)節(jié)機(jī)制。 結(jié)論:高糖通過對AMPK相關(guān)通路及細(xì)胞間隙連接蛋白Cx43的表達(dá)的調(diào)控誘導(dǎo)原代系膜細(xì)胞出現(xiàn)衰老相關(guān)表型，激活A(yù)MPK或抑制mTOR活性均可改善Cx43的表達(dá)及系膜細(xì)胞的衰老表型，而AMPK對Cx43的影響除了通過對mTOR抑制作用實現(xiàn)外還存在其他的調(diào)節(jié)作用。AMPK對系膜細(xì)胞Cx43的表達(dá)和衰老表型的調(diào)控發(fā)揮著重要的作用，為其成為糖尿病腎病治療的新靶點提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：connexin43 AMPK mTOR 系膜細(xì)胞衰老 糖尿病腎病
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-15
• 第2章 文獻(xiàn)綜述15-22
• 2.1 AMPK 的結(jié)構(gòu)與主要調(diào)節(jié)機(jī)制15-17
• 2.2 AMPK 在腎臟的分布17-18
• 2.3 AMPK 在腎臟中的生理作用18-19
• 2.4 AMPK 在腎臟病理過程中的作用19-21
• 2.5 小結(jié)與展望21-22
• 第3章 材料與方法22-31
• 3.1 實驗材料22-24
• 3.1.1 組織標(biāo)本的收集22
• 3.1.2 實驗細(xì)胞及動物22
• 3.1.3 主要試劑22-23
• 3.1.4 主要儀器23-24
• 3.2 實驗方法24-31
• 3.2.1 組織免疫熒光染色24-25
• 3.2.2 細(xì)胞分離25
• 3.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力25-26
• 3.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期26
• 3.2.5 細(xì)胞的 SA-β-gal 染色26-27
• 3.2.6 siRNA 轉(zhuǎn)染27
• 3.2.7 Western Blot 檢測 Cx43、AMPK 等蛋白質(zhì)表達(dá)水平27-29
• 3.2.8 細(xì)胞免疫熒光29-30
• 3.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理30-31
• 第4章 結(jié)果31-46
• 4.1 評估 P-AMPK、CX43 及 P21 在糖尿病腎病中的表達(dá)變化31-32
• 4.2 建立高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞衰老模型32-34
• 4.2.1 高糖培抑制系膜細(xì)胞 AMPK 的活性及 Cx43 的表達(dá)32
• 4.2.2 高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型32-34
• 4.3 抑制 AMPK 活性對 CX43 及系膜細(xì)胞衰老表型的影響34-38
• 4.3.1 下調(diào) AMPK 抑制了系膜細(xì)胞的 Cx43 的表達(dá)34-36
• 4.3.2 下調(diào) AMPK 誘導(dǎo)系膜細(xì)胞衰老表型的出現(xiàn)36-38
• 4.4 激活 AMPK 對 CX43 及系膜細(xì)胞衰老表型的影響38-40
• 4.4.1 二甲雙胍通過激活 AMPK 改善高糖對 Cx43 的抑制38
• 4.4.2 激活 AMPK 可以延緩高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的衰老38-40
• 4.5 AMPK 調(diào)控 CX43 的表達(dá)及系膜細(xì)胞的衰老40-46
• 4.5.1 AMPK 對 mTOR 的負(fù)性調(diào)控40-43
• 4.5.2 AMPK 直接調(diào)節(jié) Cx43 的表達(dá)及系膜細(xì)胞的衰老43-46
• 第5章 討論46-49
• 第6章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的研究成果60-61
• 致謝61

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本文編號：257489