【摘要】：目的糖尿病并發(fā)大血管病變發(fā)病率逐年上升,患者漸趨向年輕化。大血管病變最主要的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)異常增殖并遷移至血管內(nèi)膜下是AS形成的重要環(huán)節(jié)。線粒體融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)基因是近年來最發(fā)現(xiàn)的一種細胞增殖抑制基因,它能抑制腫瘤細胞的增殖,也參與線粒體的融合,調(diào)節(jié)線粒體的新陳代謝,維持線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。高血壓大鼠主動脈VSMC中Mfn2的表達有所下降,因此Mfn2表達上調(diào)可能會抑制該病理過程。本研究的目的為觀察外源性Mfn2基因?qū)Ω哐且餉7r5細胞增殖以及對葡萄糖代謝通路相關(guān)基因表達的影響,以期為Mfn2成為血管病變的治療靶點提供實驗依據(jù)。方法根據(jù)葡萄糖濃度將A7r5細胞分為兩組:對照組(葡萄糖濃度5.5m M)和實驗組(葡萄糖濃度15、25、35、45m M),將各組細胞培養(yǎng)72小時后與MTT孵育,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm波長處OD值以確定適宜葡萄糖濃度。再按照該濃度分別培養(yǎng)細胞24h、48h、72h后行MTT檢測確定適宜培養(yǎng)時間。應用流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期分布。然后將細胞分成兩組:正常糖對照組和高糖實驗組。RT-q PCR檢測高糖對GLUT4,PPARβ,PFK,HK m RNA表達影響。細胞分為空白對照組,p EGFP-N1組和p EGFP-mfn2組。分別于培養(yǎng)24小時后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)的表達,于轉(zhuǎn)染48小時收獲上述細胞,行MTT檢測細胞增殖,經(jīng)RT-q PCR檢測Mfn2對GLUT4、PPARβ、PFK和HK m RNA表達情況影響。采用兩樣本t檢驗和方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果(1)MTT結(jié)果:對照組(糖濃度5.5m M)和實驗組(糖濃度分別為15、25、35、45m M)OD值相比較,實驗組(15 m M:0.525±0.042,25 m M:0.680±0.031,35m M:0.635±0.012,45 m M:0.579±0.015)較對照組(0.373±0.045)均有升高,且差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05),尤其以25 m M組升高明顯。25 m M組細胞培養(yǎng)0h(0.385±0.055)相比較培養(yǎng)24h(0.679±0.033),48h(1.075±0.046),72h(1.113±0.013)OD值均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),48h和72h比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:實驗組G1期細胞比例(36.7%)與對照組(62.8%)相比降低,其差異有顯著性(F=109.8,P0.05);實驗組S期細胞比例(44.2%)較對照組(23.1%)增加,兩組差異有統(tǒng)計學意義(F=103.1,P0.05)(3)轉(zhuǎn)染后MTT檢測結(jié)果:重組質(zhì)粒擴增后轉(zhuǎn)染A7r5細胞,熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染成功后可有GFP表達,能發(fā)出特異性綠色熒光,計算轉(zhuǎn)染效率為60%。MTT檢測顯示,與未轉(zhuǎn)染組(1.105±0.011)相比較,轉(zhuǎn)染p EGFP-mfn2組(0.852±0.089)OD值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。轉(zhuǎn)染p EGFP-N1組(1.070±0.053)細胞無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)q PCR檢測顯示:與正常糖組(1)相比較,高糖組GLUT4(0.491±0.027)和PPARβ(0.521±0.273)降低,而PFK(2.426±0.610)和HK(5.757±0.946)表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。轉(zhuǎn)染48h后實驗組和兩對照組相比較,p EGFP-mfn2組的GLUT4(9.62±0.762)和PPARβ(9.06±0.663)升高,而PFK(12.72±0.272)和HK(15.75±0.551)表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.高糖能促進A7r5細胞增殖,并能使得m RNA水平GLUT4和PPARβ表達下調(diào),PFK和HK表達上調(diào)。2.Mfn2抑制高糖誘導的A7r5細胞增殖,并使得m RNA水平GLUT4和PPARβ表達上調(diào),PFK和HK表達下調(diào)。
【圖文】：

圖 1-1 A7r5 細胞培養(yǎng) 48 小時（×100）增殖影響的濃度效應顯示：與對照組5.5 mM相比較，15、25、升高，，且以25mM組升高最顯著，與對照在5.5-25 mM濃度之間，OD值隨糖濃度增勢。故此選擇25mM為最佳糖濃度進行后

其OD值均明顯升高，且以25mM組升高最顯著，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。且在5.5-25 mM濃度之間，OD值隨糖濃度增加而升高，當濃度在35mM及以上時呈下降趨勢。故此選擇25mM為最佳糖濃度進行后續(xù)實驗。見圖1-2。圖1-2 不同葡萄糖濃度對A7r5增殖的影響（*P＜0.05）3. 葡萄糖對 A7r5 細胞增殖影響的時間效應以含葡萄糖25mM的10% DMEM分別培養(yǎng)A7r5 24、48和72h，MTT檢測結(jié)果示： 24、48 和 72h OD 值分別為（ 0.679±0.033 ）， (1.075±0.046) 和（ 1.113±0.013 ），均較 0h
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉亞萍;溫紹君;劉雅;趙莉敏;郭艷紅;陳新軍;王佐廣;劉潔琳;文杰;王世奇;湯健;;增殖抑制基因在原發(fā)性高血壓患者血管平滑肌細胞增殖中的作用[J];中華心血管病雜志;2007年10期

2 陳光慧,張晨暉,朱燕青,董綱,周愛儒,馬大龍,湯鍵;一個新的高血壓病相關(guān)基因的克隆和表達[J];中華醫(yī)學雜志;1997年11期

本文編號：2567007