【摘要】：皮膚的難愈性潰瘍是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥,是糖尿病患者致殘、致死的重要因素,目前尚無有效的預(yù)防與治療措施。創(chuàng)面炎癥慢性遷延及血管再生障礙是其顯著病理特征,也是具有前景的治療靶點(diǎn)。環(huán)氧-二十碳三烯酸(EETs)是花生四烯酸細(xì)胞色素P450表氧化酶(CYP)的代謝產(chǎn)物,具有廣泛生物效應(yīng),尤其對炎癥、血管再生等病生理過程具有重要調(diào)控作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),糖尿病血管內(nèi)皮的CYP的表達(dá)量低于正常水平。糖尿病難愈性潰瘍的形成是否與CYP/EETs代謝通路異常有關(guān)?目前尚不清楚。研究目的：本課題利用小鼠皮膚創(chuàng)面模型,比較分析糖尿病及非糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面CYP代謝酶類的表達(dá)差異及其與創(chuàng)面愈合指標(biāo)的相關(guān)性；觀察外源性EETs、EET拮抗劑對創(chuàng)面愈合的影響,以及對炎癥、血管再生相關(guān)指標(biāo)的影響。進(jìn)一步在糖尿病患者與非糖尿病患者的肉芽組織實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證CYP代謝酶類的表達(dá)差異與創(chuàng)面愈合的關(guān)系。研究內(nèi)容：構(gòu)建小鼠背部皮膚損傷模型后,ob/ob小鼠被隨機(jī)地分為11,12-EET治療組、EETS拮抗劑治療組、胰島素治療組、生理鹽水治療組,C57BL/6小鼠被注射生理鹽水作為對照組。利用Western Blot、real-time PCR、 ELISA、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光組織染色等方法,在不同觀察時間點(diǎn),檢測小鼠皮膚創(chuàng)面組織P450表氧化酶(CYP2C65、 CYP2J6) mRNA及蛋白表達(dá)水平；中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目、單核/巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目、炎癥性細(xì)胞因子水平,即tumor necrosis factor (TNF)-a, interleukin (IL)-6、IL-1p的水平、金屬基質(zhì)蛋白酶蛋白表達(dá)水平以及創(chuàng)面邊緣皮膚組織及新生肉芽組織毛細(xì)血管密度。并觀察外源性EET(11,12-EET)及EETs拮抗劑(14,15-EEZE)干預(yù)后上述各項指標(biāo)的變化及其對創(chuàng)面愈合指標(biāo)的影響。研究結(jié)果：1、與C57BL/6小鼠相比,ob/ob小鼠的CYP2C65和CYP2J6的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.05)；同樣,ob/ob小鼠肉芽組織中CYP2C65和CYP2J6蛋白的表達(dá)水平與對照鼠相比顯著降低(P0.05)。2、生理鹽水干預(yù)后,ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合速率顯著地慢于C57BL/6小鼠；與生理鹽水治療組的ob/ob小鼠相比,11,12-EET可明顯加快ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合(P0.05)；相反地,EETs拮抗劑可以明顯延緩ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合,而胰島素治療組與生理鹽水治療組的創(chuàng)面愈合速率無顯著差別(P0.05)。3、ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中中性粒細(xì)胞數(shù)目及單核/巨噬細(xì)胞的數(shù)目顯著地多于C57BL/6小鼠。在ob/ob小鼠中,11,12-EET相較于生理鹽水可顯著抑制中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量(P0.05)。4、ob/ob小鼠肉芽組織中IL-1p、IL-6及TNF-α的水平顯著高于C57BL/6小鼠(P0.05),ob/ob小鼠經(jīng)11,12-EET治療后,IL-1β、IL-6及TNF-α水平明顯下降(P0.05),而經(jīng)胰島素治療后IL-1p、IL-6及TNF-α水平變化不大。5、ob/ob小鼠與C57BL/6小鼠相比,MMP-9的蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),經(jīng)11,12-EET治療后,MMP-9的蛋白量明顯降低(P0.05),而EET拮抗劑治療后,MMP-9表達(dá)量明顯升高(P0.05)。6、ob/ob小鼠創(chuàng)面的膠原沉積明顯少于C57BL/6(P0.05)。與生理鹽水治療的ob/ob小鼠相比,11,12-EET治療后創(chuàng)面膠原沉積明顯增加(P0.05)。同時,胰島素治療沒有表現(xiàn)出明顯差別,而EET拮抗劑明顯地抑制膠原沉積(P0.05)。7、創(chuàng)面創(chuàng)立第6天,新鮮的肉芽組織的免疫熒光染色顯示ob/ob小鼠的血管樣組織明顯少于C57BL/6小鼠(P0.05)。11,12-EET治療后,ob/ob小鼠的血管樣組織相比于生理鹽水治療明顯增加(P0.05),經(jīng)胰島素治療后,數(shù)量變化不大。8、將糖尿病與非糖尿病的患者相對比發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面肉芽組織中的CYP2C65及CYP2J6蛋白表達(dá)量顯著地低于正常(P0.05),但是MMP-9的蛋白表達(dá)量顯著地高于正常(P0.05)。研究結(jié)論：1、糖尿病小鼠的創(chuàng)面肉芽組織CYP表氧化酶的mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯降低。2、經(jīng)EET治療后,ob/ob小鼠的愈合速率顯著增加。3、EET可顯著地減少ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中中性粒細(xì)胞以及單核/巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目。4、EET可顯著地使ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)量降低。5、EET顯著降地低ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織中MMP-9的蛋白表達(dá)。6、EET顯著增加ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織的膠原沉積。7、EET顯著可促進(jìn)ob/ob小鼠創(chuàng)面血管生成。8、糖尿病患者的難愈性潰瘍的肉芽組織中CYP2C11及CYP2J2的蛋白表達(dá)量顯著降低,MMP-9的蛋白表達(dá)量顯著升高。總之,本研究發(fā)現(xiàn)CYP表氧化酶表達(dá)水平降低可能是導(dǎo)致糖尿病難愈性潰瘍形成的重要因素之一。外源性EET可能通過其抗炎及加速血管再生促進(jìn)糖尿病皮膚損傷愈合。研究意義：明確EETs/CYP代謝通路是影響糖尿病皮膚損傷愈合的重要因素之一；進(jìn)一步揭示糖尿病難愈性潰瘍的病理生理機(jī)制,為臨床糖尿病難愈性潰瘍的防治提供了新思路及治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2

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