發(fā)布時間：2019-11-08 01:25

【摘要】：背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種多器官受累的系統(tǒng)性自身免疫病,主要表現(xiàn)為T、B細(xì)胞異常激活,自身抗體累積,炎性細(xì)胞因子增多等。近年來研究顯示,巨噬細(xì)胞在SLE發(fā)病機制中扮演重要角色。而本課題組發(fā)現(xiàn)對于部分難治性SLE患者,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)移植治療取得了較好的療效,但MSC治療SLE的機制及其對SLE巨噬細(xì)胞的調(diào)控尚不清楚。目的:本研究系統(tǒng)地分析了 SLE巨噬細(xì)胞的表型和功能;體外探討UCMSC對SLE巨噬細(xì)胞表型和功能的影響;并通過狼瘡鼠模型進一步探討UCMSC移植治療對狼瘡鼠腹腔及腎臟巨噬細(xì)胞的影響。方法:密度梯度離心法(Ficoll法)分離SLE患者和健康對照(HC)外周單個核細(xì)胞(PBMC),磁珠分選CD14+單核細(xì)胞,應(yīng)用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)7天,分化為成熟巨噬細(xì)胞,更換培養(yǎng)液,將此巨噬細(xì)胞以5:1比例在transwell培養(yǎng)體系下與或不與UCMSC共培養(yǎng)2天。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測巨噬細(xì)胞表面CD206表達(dá),Real-time PCR和ELISA法檢測巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGFβ1、TNFα和iNOS表達(dá)。取健康人CD4+T細(xì)胞,以5:1比例分別與HC、SLE、UCMSC處理SLE巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),抗CD3/CD28刺激4天,CFSE標(biāo)記檢測CD4+T細(xì)胞增殖比例。應(yīng)用2μm熒光微球(1:100稀釋)與HC巨噬細(xì)胞、SLE巨噬細(xì)胞、UCMSC處理SLE巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2小時,FACS檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性。取健康人中性粒細(xì)胞,體外37℃培養(yǎng)24小時后,檢測凋亡率后,作為凋亡細(xì)胞備用。應(yīng)用CFSE標(biāo)記凋亡細(xì)胞,以5:1比例分別與HC巨噬細(xì)胞、SLE巨噬細(xì)胞、UCMSC處理SLE巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2小時,FACS檢測巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞能力。同時檢測UCMSC基礎(chǔ)狀態(tài)、與HC巨噬細(xì)胞以及與SLE巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下,UCMSC免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。動物體內(nèi)實驗中,我們將24周齡雌性B6.MRL-Faslpr狼瘡鼠隨機分為4組,分別為空白對照組、UCMSC移植治療組、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamid,CTX)治療組和成纖維細(xì)胞(fibrolast-like synoviocytes,FLS)移植對照組,24 周齡雌性 C57BL/6 鼠作為正常對照。UCMSC和FLS均以1 × 106數(shù)量尾靜脈輸注相應(yīng)治療組狼瘡鼠體內(nèi),CTX組狼瘡鼠腹腔注射CTX 100mg/kg/day 2天,全部小鼠于28周齡處死。我們檢測小鼠腎臟病理、脾臟指數(shù)和脾臟各淋巴細(xì)胞分群,評估療效。同時將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和腎臟巨噬細(xì)胞分離純化,流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面CD206表達(dá),在或不在LPS刺激下,ELISA法檢測小鼠巨噬細(xì)胞IL-10、TGFβl和TNFα的水平。同時無菌取8周齡雌性C57BL/6小鼠脾臟,磁珠分選脾臟CD4+T細(xì)胞,將其以5:1比例與實驗小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),抗CD3/CD28刺激4天,CFSE法檢測CD4+T細(xì)胞增殖。應(yīng)用2μm熒光微球(1:100稀釋)與小鼠腹腔/腎臟巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2小時,FACS檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性。結(jié)果:SLE巨噬細(xì)胞表面CD206表達(dá)量顯著下降,抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGFβ1表達(dá)顯著降低,而且SLE巨噬細(xì)胞不能有效抑制CD4+T細(xì)胞增殖,與此同時SLE巨噬細(xì)胞對熒光微球和凋亡細(xì)胞的吞噬率下降。UCMSC可顯著提高SLE巨噬細(xì)胞表面CD206表達(dá)量,逆轉(zhuǎn)其對CD4+T細(xì)胞增殖抑制能力缺陷,增強對熒光微球和凋亡細(xì)胞吞噬率,但UCMSC對SLE巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的作用甚微,僅能下調(diào)LPS刺激下TNFα的水平,而對IL-10、TGFβ1和iNOS無明顯作用。與此同時我們發(fā)現(xiàn),SLE巨噬細(xì)胞可顯著上調(diào)UCMSC部分免疫調(diào)節(jié)分子(HGF、TGFβl和HO-1)。體內(nèi)實驗驗證UCMSC移植治療可顯著上調(diào)狼瘡鼠腹腔巨噬細(xì)胞和腎臟巨噬細(xì)胞CD206表達(dá),顯著提高狼瘡鼠腹腔巨噬細(xì)胞和腎臟巨噬細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制能力,增強狼瘡鼠腹腔和腎臟巨噬細(xì)胞對熒光微球的吞噬能力,而UCMSC移植治療并不能顯著影響狼瘡鼠巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),與體外結(jié)果一致。結(jié)論:SLE巨噬細(xì)胞表型、抗炎細(xì)胞因子表達(dá)、免疫調(diào)節(jié)能力和吞噬功能均異常。UCMSC可改善SLE巨噬細(xì)胞表型、免疫調(diào)節(jié)能力和吞噬功能,但對促炎-抗炎相關(guān)因子的產(chǎn)生影響甚微。UCMSC移植治療狼瘡鼠可顯著改善狼瘡鼠腹腔和腎臟巨噬細(xì)胞表型、免疫調(diào)節(jié)能力和吞噬功能,提示UCMSC對SLE巨噬細(xì)胞的調(diào)控有可能是UCMSC發(fā)揮治療作用的一個重要機制。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

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本文編號：2557584