【摘要】：目的:由于糖尿病及其并發(fā)癥治療困難且造成的財政壓力巨大,因此最新的指南要求糖尿病的管理重在早期預防。IGT(impaired glucose tolerance,糖耐量減低)期是進展至糖尿病的一個重要階段,在此期進行干預可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)2型糖尿病的進展。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)雙水楊酸酯還有調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的作用,但機制并不十分明確。目前大量研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的紊亂與2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。本研究使用自發(fā)2型糖尿病模型——ZDF大鼠作為研究對象,從IGT期開始予小劑量(50mg/kg.d-1)雙水楊酸酯(salsalate,SAL)進行干預,觀察雙水楊酸酯對血脂、血糖的改善作用和腸道菌群多樣性及不同分類水平上菌群豐度的改善情況,初步探討雙水楊酸酯調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂、預防2型糖尿病的可能機制。方法:1.以ZDF大鼠為研究對象,同周齡的ZL大鼠作為同品系的正常對照組(簡稱“正常組”)。每周行OGTT,根據(jù)血糖值將不同周齡的ZDF大鼠分為NGT(normal glucose tolerance,糖耐量正常)期、IGT期、糖尿病(diabetes,DM)期3個階段。在IGT期將ZDF大鼠分為模型組和SAL干預組,干預組每日給予雙水楊酸酯(50mg/kg.d-1)灌胃。留取不同周齡大鼠的血、尿、便及回腸組織。2.生化法檢測大鼠甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平。3.ELISA法檢測不同周齡大鼠空腹胰島素、空腹胰高血糖素的水平,并計算HOMA-IR指數(shù)。4.生化法檢測不同周齡大鼠肝、腎功能及24h尿蛋白水平的變化。5.16S rDNA焦磷酸測序技術(shù)檢測不同周齡大鼠腸道菌群多樣性及不同分類水平上的相對豐度。6.光鏡、電鏡觀察不同周齡大鼠回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫組織化學染色法檢測回腸緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin)的表達量。7.ELISA法測定回腸組織上清液中脂多糖(LPS)水平,免疫熒光法檢測大鼠回腸巨噬細胞M1、M2的表達量,RT-PCR法檢測回腸組織M1、M2型巨噬細胞相關(guān)mRNA(IL-1、IL-4、IL-10、IL-12、iNOS、Arg-1)的表達量。免疫組化法檢測TIL4、NFкB、TNFα的表達量。結(jié)果:一、雙水楊酸酯對ZDF大鼠糖脂代謝的干預效果1.9周齡時,20只ZDF大鼠全部發(fā)生糖耐量異常。12周齡時,ZDF模型組大鼠(10只)100%發(fā)生糖尿病,而雙水楊酸酯干預組(10只)僅有1只符合IGT的診斷,其余9只糖耐量均恢復至正常糖耐量。2.NGT期、IGT期、DM期ZDF大鼠的葡萄糖曲線下面積均高于ZL大鼠(P㩳0.05)。DM期(12周齡)SAL干預組葡萄糖曲線下面積低于同周齡模型組(P㩳0.05),與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)。DM期模型組膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白高于正常組(P㩳0.05),SAL干預組膽固醇、高密度脂蛋白水平低于模型組(P㩳0.05)。3.IGT期、DM期模型組大鼠的空腹胰島素分泌量低于同周齡的正常對照組,而空腹胰高血糖素明顯高于正常對照組(P㩳0.05)。12周齡時SAL干預組與模型組大鼠相比胰島素分泌水平明顯升高(7.5±0.4ng/m L vs.5.4±0.7ng/mL,P㩳0.05),而胰高血糖素較模型組明顯減少(P㩳0.05)。IGT期、DM期ZDF模型組大鼠胰島素抵抗指數(shù)均高于同周齡的ZL大鼠。12周齡時雙水楊酸酯干預組胰島素抵抗指數(shù)低于同周齡模型組(3.2±0.9 vs.5.6±2.0,P㩳0.05)。4.實驗終止時(12周齡),全部雙水楊酸酯干預組大鼠的肝腎功能、24小時尿蛋白與正常對照組、模型組相比均未見顯著差異(P㧐0.05)。二、雙水楊酸酯通過調(diào)節(jié)ZDF大鼠腸道菌群紊亂預防2型糖尿病發(fā)生的機制探討1.菌群多樣性變化:ZDF模型組大鼠隨糖尿病病程的進展α多樣性逐漸減少。ZL正常組大鼠在不考慮每個物種的豐度時,各個時期比較無統(tǒng)計學差異,但若考慮每個物種的豐富度,則DM期的物種多樣性較前兩期是減少的(P㩳0.05)。12周齡時雙水楊酸酯干預組腸道菌群α多樣性高于模型組(P㩳0.05)。在NGT期正常組與模型組的β多樣性即存在差異。模型組大鼠隨病程進展β多樣性差異逐漸增大,12周齡時雙水楊酸酯干預組菌群的β多樣性與正常組相近。2.菌門水平比較:NGT期正常組大鼠的放線菌門的相對豐度較模型組大鼠高(P㩳0.05)。模型組大鼠隨病程進展硬壁菌門、疣微菌門的相對豐度逐漸減少,擬桿菌門相對豐度逐漸增加。DM期模型組大鼠與正常組相比硬壁菌門、放線菌門、疣微菌門的相對豐度較低(P㧐0.05),雙水楊酸酯干預組與正常組硬壁菌門、疣微菌門的相對豐度相比未見統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)。3.菌屬水平比較:NGT期正常組大鼠較模型組大鼠擬桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬、羅斯氏菌屬相對豐度低,較ZDF大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度高。模型組大鼠隨糖尿病進展擬桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌、羅斯氏菌屬、毛螺菌屬、薩特菌屬、Akkermansia屬的相對豐度逐漸減少,普雷沃菌屬相對豐度逐漸增高,而乳酸桿菌呈先增高后降低的趨勢。DM期模型組大鼠較正常組普雷沃菌屬的相對豐度高,而梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、羅斯氏菌屬、Akkermansia屬的相對豐度低。干預組羅斯氏菌屬相對豐度高于模型組(P㩳0.05)。4.腸道結(jié)構(gòu)和功能的改變:回腸病理結(jié)果示模型組大鼠隨糖尿病的進展腸上皮完整性,緊密連接、腸絨毛損傷逐漸加重,干預組腸道損傷較模型組輕。免疫組化染色示模型組大鼠腸粘膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達量較正常組減少。而干預組緊密連接蛋白表達量較模型組增加。5.腸道炎癥指標的變化:IGT期、DM期模型組大鼠回腸上清液脂多糖(LPS)高于同周齡正常組,12周齡時干預組LPS水平低于模型組。12周齡時模型組大鼠回腸M1型巨噬細胞及其標志物mRNA表達量高于正常組,M2型巨噬細胞及其標志物mRNA表達量低于正常組,干預組M1型巨噬細胞及其標志物表達量低于模型組而M2型巨噬細胞及其標志物mRNA表達量高于模型組。結(jié)論:1、小劑量雙水楊酸酯早期干預可改善ZDF大鼠的糖脂代謝,促進其胰島素分泌,減少其胰高血糖素分泌,改善胰島素抵抗,有效預防2型糖尿病的發(fā)生。2、雙水楊酸酯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂發(fā)揮預防糖尿病的作用,其可能作用機制:雙水楊酸酯通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂減少LPS的產(chǎn)生,保護腸道的結(jié)構(gòu)和功能,防止LPS進入體內(nèi),減少巨噬細胞的極化,進而減少炎性因子的產(chǎn)生,促進抑炎因子的生成,改善慢性炎癥狀態(tài),預防2型糖尿病的發(fā)生。3、小劑量雙水楊酸酯預防2型糖尿病具有較好安全性。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文二、雙水楊酸酯通過調(diào)節(jié) ZDF 大鼠腸道菌群紊亂預防 2 型糖尿病發(fā)生的機制探討數(shù)、chao 指數(shù)、ace 指數(shù)明顯高于模型組大鼠（P㩳0.05），雙水楊酸酯干預組的observed species 指數(shù)、chao 指數(shù)、ace 指數(shù)低于模型組（P㩳0.05）。比較三組之間 shannon 指數(shù)以及 simpson 指數(shù)無統(tǒng)計學意義（P㧐0.05，，圖 4）。

不同周齡正常組大鼠腸道菌群α多樣性比較
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2555445