發(fā)布時間：2017-03-18 01:01

  本文關鍵詞：內質網應激在高糖誘導系膜細胞表型轉化中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 目前糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率在全世界范圍內正在急劇增加，是引起終末期腎衰竭的最常見原因，其病情進展快，治療難度大，由于其發(fā)病機理尚未完全闡明，缺乏有效防治手段，致殘致死率高，已經成為腎臟醫(yī)學領域最急迫需要解決的問題。糖尿病腎病的主要病理特征是HGMCs增殖和胞外基質(ECM)聚集。在此病理過程中，高血糖引起的HGMCs的表型轉化是一個關鍵性環(huán)節(jié)，表現為HGMCs肥大、α-SMA的異常表達、ECM大量分泌等。大量研究認為，高糖刺激細胞代謝應激反應的多效性是典型的信號網絡失衡，DN發(fā)病與腎小球的血流動力學改變、系膜細胞多元醇代謝途徑異常、蛋白非酶糖化和大分子糖化終末產物(AGEs)的生成、細胞因子的異常表達等因素密切相關。而目前的研究表明，內質網應激(ERS)很可能就是高糖所致細胞內信號反應網絡失衡的總開關。內質網作為細胞內最大的細胞器之一，具有大面積的膜結構，其內質網膜內外除合成折疊的蛋白質外，還駐留有大量的信號蛋白分子，故其發(fā)揮的功能遠遠不止既往認為的蛋白質糖基化以及輔助蛋白質正確折疊，事實上它在將細胞質信號與線粒體、細胞核功能偶聯方面發(fā)揮了重要作用，扮演著關鍵角色。目前，內質網作為細胞漿信號網絡調節(jié)的整合器這一功能已受到高度重視。而既往研究已證實，糖尿病引起的高糖狀態(tài)可以誘導包括HGMCs在內的多種腎臟靶細胞發(fā)生ERS。由此推測，對ERS進行調控進而對DN高糖環(huán)境誘導的HGMCs發(fā)生細胞表型轉化產生作用，可能影響DN腎臟損傷的進程，從而有可能為有效的治療糖尿病腎病的找到新的思路。而已在多種動物模型中成功應用的4-苯基丁酸(4-PBA)是一類小分子伴侶，近期研究發(fā)現它可以運輸突變蛋白，從而具有穩(wěn)定蛋白構象，改善內質網折疊能力。因此，予以4-PBA進行干預來控制ERS的輕度，可能為DN的臨床治療提供新的途徑。 目的 本研究擬用高糖刺激HGMCs，動態(tài)觀察在高糖環(huán)境下，系膜細胞表型轉化情況和發(fā)生內質網應激的情況，其次，通過應用分子伴侶4-PBA調控內質網應激強度觀察對系膜細胞在高糖刺激下的作用，以期明確高糖誘導HGMCs發(fā)生表型轉化過程中內質網應激的作用并初步闡明其機制。 方法 1.將培養(yǎng)的HGMCs分為NC組、高糖組(HG組)和HG+4-PBA組。 2.采用CCK-8試劑盒進行細胞增殖率測定。 3.使用流式細胞儀進行細胞周期測定。 4.免疫組化方法檢測HGMCs中的α-SMA表達。 5.實時定量RT-PCR方法測定各組各時相點重要分子如Grp78、TGFβ1、FN、NOX4、NF-kB的基因表達相對量(RQ)。 6.用Western-blot方法測定各組各時相點上述重要分子的蛋白表達水平變化情況。 結果 1.高糖刺激HGMCs早期即發(fā)生內質網應激反應，而藥物分子伴侶4-PBA可以抑制內質網應激反應的發(fā)生。具體而言，Grp78是重要的內質網分子伴侶，其特異性的表達標志著內質網應激反應的發(fā)生。對照組Grp78mRNA始終處于較低的表達水平；而予以高糖刺激后Grp78mRNA表達在早期(6h)即較對照組顯著上調，其表達在12h達高峰，而后逐漸下降，但仍顯著高于對照組；予以藥物分子伴侶4-PBA可明顯的抑制高糖誘導的Grp78mRNA表達上調，差異有統(tǒng)計學意義。同時，高糖刺激后，與對照組相比Grp78蛋白表達明顯增加，而予以4-PBA干預可以明顯抑制這種增高趨勢。 2.高糖刺激后系膜細胞增殖明顯增快，與對照組差異有統(tǒng)計學意義；細胞增殖指數PI值也顯示明顯升高；高糖刺激同時給予小分子伴侶4-PBA(5mmol/L)干預，系膜細胞增殖活性在48h受到顯著抑制，而細胞增殖指數則從24h起即受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義。 3.對照組系膜細胞存在低水平的α-SMA表達，高糖刺激可增加α-SMA表達。用5mmol/L4-PBA干預可以顯著抑制高糖誘導的α-SMA表達。應用IPP軟件分析熒光強度顯示，HG組顯著高于正常對照組，而應用4-PBA干預后使熒光強度較HG組降低，差異有統(tǒng)計學意義。 4.予以高糖刺激后TGFβ1mRNA的表達較正常對照組明顯增加，在24h左右達高峰，顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的TGFβ1mRNA的表達上調，差異有統(tǒng)計學意義。同樣的，高糖刺激可誘導TGFβ1蛋白的表達明顯增加，而予以4-PBA干預后可以抑制增高趨勢。 5.予以高糖刺激后FN mRNA的表達明顯增加，在24h左右達高峰，，顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的FN mRNA的表達上調，差異有統(tǒng)計學意義。 6.予以高糖刺激后Nox4mRNA的表達明顯增加，顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的Nox4mRNA的表達上調，差異有統(tǒng)計學意義。 7.予以高糖刺激后NF-kB mRNA的表達明顯增加，顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的NF-kB mRNA的表達上調，差異有統(tǒng)計學意義。 結論 1.高糖培養(yǎng)條件下可誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型轉化，即由靜息型向活躍型轉化，表現為細胞形態(tài)學發(fā)生改變，亞細胞結構中內質網等細胞器增生活躍；同時細胞增殖速度、增殖指數等均高于對照組；免疫細胞學研究表明高糖誘導下人腎系膜細胞大量合成表達α-SMA是細胞發(fā)生表型轉化的有力證據； 2.在高糖誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型轉化的過程中早期即有內質網應激反應的參與，而應用藥物分子伴侶4-PBA可以抑制此過程中的內質網應激反應； 3.應用分子伴侶4-PBA早期調控內質網應激反應可以顯著對抗高糖培養(yǎng)誘導人腎系膜細胞表型轉化的作用，并抑制此過程中一些關鍵細胞因子如TGF-β1、FN等mRNA及其蛋白合成，提示調控內質網應激可能通過抑制上述關鍵分子的表達完成對細胞表型轉化的抑制作用； 4.在此過程中，應用分子伴侶4-PBA早期調控內質網應激反應同樣可以顯著下調高糖培養(yǎng)誘導人腎系膜細胞表型轉化過程中氧化應激通路以及炎癥反應通路的關鍵細胞因子如Nox4、NF-kB等mRNA的表達，并同樣的抑制其蛋白合成，提示高糖誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型轉化是多條信號通路、多種細胞因子參與的復雜信號網絡失衡的過程，而調控內質網應激可能正是該信號網絡調控的關鍵點。 綜上所述，高糖可誘導體外培養(yǎng)的人腎系膜細胞發(fā)生細胞表型轉化，表現為過度增殖并上調α-SMA、TGF-β1、FN等的表達，此過程中伴隨有ERS的發(fā)生，且抑制ERS程度可相應的抑制細胞增殖及下調HGMCs表達α-SMA、TGF-β1、FN等重要因子。同時，此過程中還有其他信號通路的參與，如Nox4、NF-kB等也發(fā)生了類似變化，這提示了ERS在此過程中對胞內信號網絡失衡的重要調節(jié)作用，ERS確實發(fā)揮了胞漿信號整合的關鍵作用。因此，下一步深入探討如何通過調控ERS強度、持續(xù)時間，改變細胞生理或病理反應的走向，將對臨床治療DN提供重要的新方向。
【關鍵詞】：糖尿病腎病 人腎臟系膜細胞 內質網應激 細胞表型轉化 分子伴侶4-苯基丁酸
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R692.5
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料與方法14-25
• 3. 結果25-35
• 4. 討論35-42
• 全文結論42-43
• 參考文獻43-50
• 文獻綜述 內質網應激在糖尿病腎病中的研究進展50-57
• 參考文獻54-57
• 在讀期間發(fā)表論文57-58
• 致謝58

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