【摘要】：目的： 根據(jù)臨床流行病學(xué)資料和我們多年來(lái)的實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀察，認(rèn)為成骨活躍和骨轉(zhuǎn)換加速是氟骨癥進(jìn)展期的重要特征和形成骨病變多樣性的病理基礎(chǔ)，，膳食低鈣是氟骨癥的主要促發(fā)和加重因素，整體低鈣—甲旁腺素（PTH）分泌增多—靶細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高這種“鈣矛盾”（Calcium paradox）參與了氟骨癥的發(fā)病機(jī)制。但其確切作用機(jī)理尚不明確。甲旁腺素相關(guān)肽（PTH-rp）具有明顯的PTH活性，在人體骨微環(huán)境中扮演重要角色，對(duì)先天骨發(fā)育和后天骨的代謝均有重要作用，在生理和病理狀態(tài)下調(diào)控靶細(xì)胞的增殖和分化。成骨細(xì)胞自身可以合成PTH-rp及其受體，以自分泌和旁分泌方式在骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。鑒于迄今氟骨癥發(fā)病機(jī)制研究中尚未深入涉及PTH-rp，因而是本項(xiàng)目研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。鈣敏感受體（calcium sensing receptor，CaSR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，廣泛分布于甲狀旁腺、甲狀腺C細(xì)胞、腎臟、骨和腸等組織，在維持機(jī)體鈣穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡方面起重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明，CaSR對(duì)成骨細(xì)胞分化和甲狀旁腺功能均有重要作用。在研究氟骨癥骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)發(fā)生機(jī)制的過(guò)程中，CaSR的作用值得關(guān)注，但有關(guān)這一方面迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。因此也作為本研究重點(diǎn)探討內(nèi)容。 本課題將通過(guò)氟中毒動(dòng)物模型和體外成骨細(xì)胞染氟，觀察氟對(duì)動(dòng)物血清和體外細(xì)胞培養(yǎng)上清鈣離子濃度、骨組織和成骨細(xì)胞中PTH、PTH-rp的mRNA和蛋白表達(dá)，探討PTH、PTH-rp在促進(jìn)成骨細(xì)胞功能活躍和骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)中的分子機(jī)制；同時(shí)，觀察CaSR在染氟成骨細(xì)胞中的變化并探討其可能作用。 方法： 分為體內(nèi)和體外兩部分進(jìn)行。 體內(nèi)部分： 將40只SD大鼠按體重分為四組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，利用富鈣平衡飼料和低鈣偏食飼料飼養(yǎng)大鼠,并經(jīng)飲水投氟(分析純NaF)復(fù)制氟中毒模型每日更換食水,實(shí)驗(yàn)期限為2個(gè)月。具體分組和實(shí)驗(yàn)處理因素如下表：表1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理因素 實(shí)驗(yàn)期末檢測(cè)氟中毒大鼠血清中鈣離子濃度,骨組織中PTH、PTh-rp、CaSR, CPG、RANKL等的mRNA和蛋白表達(dá);體外部分： 應(yīng)用成骨細(xì)胞株(MC3T3-E1)。實(shí)驗(yàn)處理因素如下表：表2細(xì)胞染氟及分組 應(yīng)用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)培養(yǎng)液中鈣離子濃度,Realtime-PCR和Western Blot法檢測(cè)PTH, PTH-rp、CaSR mRNA和蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1)與富鈣平衡對(duì)照組(ctrl組)比較,富鈣平衡加氟組(G1組)血清鈣離子濃度降低;PTH mRNA表達(dá)明顯降低,蛋白表達(dá)明顯升高(P0.01);PTH-rp mRNA及蛋白量均明顯降低(P0.05); CaSR mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05);CT mRNA表達(dá)降低,蛋白表達(dá)升高(P0.01);骨組織中OPG, RANKL mRNA及蛋白量、RANKL/OPG mRNA及蛋白比值均有不同程度增加,其中RANKL mRNA和RANKL/OPG mRNA比值明顯升高（P0.01）； 2）與偏食低鈣對(duì)照組（G2組）比較，偏食低鈣加氟組（G3組）大鼠血清游離鈣離子濃度明顯降低； PTH和PTH-rp mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.01，P＜0.05）；CaSR mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01，P＜0.05）；CT mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01）；OPG mRNA表達(dá)明顯升高（P0.01）；RANKLmRNA明顯下降，RANKL/OPG mRNA比值明顯下降；與G2組比較，G3組OPG蛋白表達(dá)明顯升高，RANKL蛋白表達(dá)稍有升高，RANKL/OPG蛋白比值明顯下降。 2.體外實(shí)驗(yàn)： 1）與對(duì)照組（C組）相比，F(xiàn)2組細(xì)胞上清液中游離鈣離子濃度明顯升高（P＜0.01），F(xiàn)5、F10組鈣離子濃度明顯降低（P＜0.05， P＜0.01）； 2）本實(shí)驗(yàn)中較低濃度氟（2mg/L F-、5mg/L F-）可刺激細(xì)胞活性，而高劑量氟（10mg/L F-）則抑制細(xì)胞活性； 3）與C組相比，F(xiàn)2、F5組細(xì)胞PTH、PTH-rp mRNA及蛋白量均明顯降低，F(xiàn)10組明顯升高（P＜0.05）； 4）與C比較，染氟各組細(xì)胞CT mRNA及蛋白降低；CaSR mRNA及蛋白量增加（P＜0.05， P＜0.01）。 結(jié)論： 1.細(xì)胞外鈣離子濃度與染氟濃度密切相關(guān)； 2.氟對(duì)成骨細(xì)胞的作用具有劑量依賴關(guān)系； 3.氟作用下，無(wú)論是體內(nèi)或體外，PTH、PTH-rp mRNA、蛋白表達(dá)均發(fā)生明顯波動(dòng)；其中在體內(nèi)除富鈣平衡膳食組PTH蛋白呈增強(qiáng)效應(yīng)外，其他均以明顯抑制為主；高劑量染氟（10mg/LF-）成骨細(xì)胞中PTH、PTH-rp mRNA和蛋白均呈高表達(dá)狀態(tài)（P＜0.01）； 4.氟中毒動(dòng)物骨組織和染氟成骨細(xì)胞中CaSR mRNA、蛋白表達(dá)量均明顯增加； 5.體內(nèi)、體外CT基因的表達(dá)均受氟的抑制，蛋白的表達(dá)則體內(nèi)外表現(xiàn)有差異，其原因有待探索； 6. OPGL/OPG mRNA和蛋白表達(dá)和比值在富鈣平衡氟中毒大鼠骨組織和偏食低鈣氟中毒大鼠骨組織中的表達(dá)結(jié)果差異很大，前者明顯升高，后者結(jié)果相反。 上述結(jié)果提示一定劑量的氟無(wú)論在體內(nèi)或體外均可導(dǎo)致PTH和PTH-rp產(chǎn)生明顯波動(dòng)，這種變化在體內(nèi)既受膳食中鈣含量的影響，也和體內(nèi)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)有關(guān)，但總的趨勢(shì)是氟可導(dǎo)致PTH和PTH-rp表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步證明整體低鈣刺激PTH分泌增多以及后來(lái)的一系列變化在氟中毒發(fā)生機(jī)制中的重要地位；氟在體內(nèi)和體外對(duì)CaSR表達(dá)的明顯刺激作用進(jìn)一步提示在氟骨癥發(fā)生機(jī)制中，即整體低鈣—PTH分泌增多—成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高過(guò)程中，CaSR可能地位舉足輕重。氟對(duì)CT的抑制以及對(duì)RANKL/OPG mRNA比值的刺激或抑制作用進(jìn)一步證明氟對(duì)骨轉(zhuǎn)換的重要作用以及膳食低鈣狀態(tài)在氟中毒發(fā)生中的協(xié)同效應(yīng)。
【圖文】：

圖 2.1 偏食加氟組大鼠牙齒改變 2.5.2 氟中毒大鼠體重變化實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中監(jiān)測(cè)大鼠的體重變化，結(jié)果顯示 1 周起偏食對(duì)照組和偏食加氟組大鼠體重增加較常食對(duì)照組、常食加氟組緩慢，2 周開(kāi)始常規(guī)食加氟組大鼠體重增加較常規(guī)食對(duì)照組緩慢；隨著投氟時(shí)間的延長(zhǎng)各種體重增長(zhǎng)開(kāi)始變化不大，呈現(xiàn)出氟毒性耐受趨勢(shì)。200300400500常食對(duì)照 組常食加 氟組偏 食對(duì)照組偏 食加 氟組體重（g）

升高； 與 G2 組比較，G3 組 PTH mRNA 及蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.01）（如圖 2.2）。圖2.3 大鼠骨組織PTH mRNA、蛋白表達(dá)與常食對(duì)照組相比 * P＜0.05, ** P＜0.01.2.5.3.2 大鼠骨組織 PTH-rp mRNA、蛋白表達(dá)分析與 ctrl 組相比， G1 組 PTHrp mRNA 及蛋白表達(dá)明顯降低 (P＜0.05）；與G2 組比較，G3 組 PTHrp mRNA 及蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.01, P＜0.05）（如圖 2.3）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R599.1

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1 王瑩;氟作用條件下PTH、PTH-rp、CaSR表達(dá)變化及在氟骨癥發(fā)生機(jī)制中的作用[D];吉林大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2534439