發(fā)布時(shí)間：2019-07-31 17:03

【摘要】：目的:探討腫瘤壞死因子α(TNF-α)能否誘導(dǎo)小鼠長骨骨樣細(xì)胞株MLO-Y4發(fā)生程序性壞死及其發(fā)生機(jī)制。方法:將MLO-Y4細(xì)胞分為正常對照(control)組、TNF-α處理組、TNF-α+necrostatin-1(Nec-1)處理組、TNF-α+Z-VAD處理組和TNF-α+受體相互作用蛋白3(RIP3)-siRNA組。用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡或壞死率,透射電鏡鑒定細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,用Western blot法測定RIP1、RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察RIP1和RIP3蛋白的共表達(dá),應(yīng)用熒光標(biāo)記法檢測各組細(xì)胞活性氧(ROS)水平。結(jié)果:TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞24 h,凋亡和壞死率明顯高于control組(P0.01)。與TNF-α組相比,Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能降低細(xì)胞的凋亡或壞死率(P0.01)。在TNF-α組可見大量壞死樣細(xì)胞,在Z-VAD組仍可見到壞死樣細(xì)胞,而在Nec-1和RIP3-siRNA組未見到壞死樣細(xì)胞。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Nec-1可有效抑制RIP1蛋白表達(dá),而Z-VAD對RIP1和RIP3蛋白表達(dá)無影響,RIP3-siRNA可有效降低RIP3蛋白表達(dá)(P0.01)。與TNF-α組比較,Nec-1可有效降低RIP1-RIP3蛋白共表達(dá)陽性細(xì)胞百分率(P0.01),而Z-VAD對其無影響。與control組相比,TNF-α組的ROS水平明顯增高(P0.01);與TNF-α組相比,Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P0.01)。結(jié)論:TNF-α能誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞發(fā)生RIP3介導(dǎo)的程序性壞死;ROS可能是MLO-Y4細(xì)胞程序性壞死的執(zhí)行者。
【圖文】：

Figure2．Comparisonofapoptosis/necrosisrateineachgroup．Mean±SEM．n=3．##P＜0．01vscontrolgroup;＊＊P＜0．01vsTNF-αgroup．圖2各組MLO-Y4細(xì)胞凋亡或壞死率的比較組同樣可以見到壞死的細(xì)胞。而TNF-α+Nec-1和TNF-α+ＲIP3-siＲNA組未發(fā)現(xiàn)明顯壞死的細(xì)胞，僅見少數(shù)細(xì)胞線粒體呈輕度腫脹，見圖3。Figure3．ThemorphologicalchangesofMLO-Y4cellswerevisualizedbyTEM．Thescalebar=2μm．圖3透射電鏡觀察各組MLO-Y4細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化4TNF-α對MLO-Y4細(xì)胞程序性壞死特異性蛋白表達(dá)的影響ＲIP1和ＲIP3是程序性壞死發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號分子，且二者相互作用參與形成促程序性壞死小體［11］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測了ＲIP1和ＲIP3蛋白在MLO-Y4細(xì)胞的共表達(dá)情況。鏡下可見ＲIP1和ＲIP3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿，ＲIP1(紅色)和ＲIP3(綠色)陽性細(xì)胞表達(dá)重疊呈黃色，見圖4。共表達(dá)陽性率結(jié)果顯示，，與對照組相比，TNF-α組細(xì)胞ＲIP1和ＲIP3的共表達(dá)陽性率明顯增高(P＜0．01)，Nec-1和ＲIP3-siＲNA能有效降低MLO-Y4細(xì)胞ＲIP1和ＲIP3共表達(dá)陽性率(P＜0.01)，見圖5。應(yīng)用Westernblot檢測程序性壞死關(guān)鍵蛋白ＲIP1、ＲIP3及凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3的表達(dá)水平。與對照相比，TNF-α組的ＲIP1、ＲIP3及cleavedcaspase-3蛋白水平明顯增高(P＜0.01)。Nec-1能有效抑制ＲIP1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，而·1502·

Figure2．Comparisonofapoptosis/necrosisrateineachgroup．Mean±SEM．n=3．##P＜0．01vscontrolgroup;＊＊P＜0．01vsTNF-αgroup．圖2各組MLO-Y4細(xì)胞凋亡或壞死率的比較組同樣可以見到壞死的細(xì)胞。而TNF-α+Nec-1和TNF-α+ＲIP3-siＲNA組未發(fā)現(xiàn)明顯壞死的細(xì)胞，僅見少數(shù)細(xì)胞線粒體呈輕度腫脹，見圖3。Figure3．ThemorphologicalchangesofMLO-Y4cellswerevisualizedbyTEM．Thescalebar=2μm．圖3透射電鏡觀察各組MLO-Y4細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化4TNF-α對MLO-Y4細(xì)胞程序性壞死特異性蛋白表達(dá)的影響ＲIP1和ＲIP3是程序性壞死發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號分子，且二者相互作用參與形成促程序性壞死小體［11］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測了ＲIP1和ＲIP3蛋白在MLO-Y4細(xì)胞的共表達(dá)情況。鏡下可見ＲIP1和ＲIP3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿，ＲIP1(紅色)和ＲIP3(綠色)陽性細(xì)胞表達(dá)重疊呈黃色，見圖4。共表達(dá)陽性率結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組細(xì)胞ＲIP1和ＲIP3的共表達(dá)陽性率明顯增高(P＜0．01)，Nec-1和ＲIP3-siＲNA能有效降低MLO-Y4細(xì)胞ＲIP1和ＲIP3共表達(dá)陽性率(P＜0.01)，見圖5。應(yīng)用Westernblot檢測程序性壞死關(guān)鍵蛋白ＲIP1、ＲIP3及凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3的表達(dá)水平。與對照相比，TNF-α組的ＲIP1、ＲIP3及cleavedcaspase-3蛋白水平明顯增高(P＜0.01)。Nec-1能有效抑制ＲIP1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，而·1502·
【作者單位】： 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科;海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科;
【基金】：海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.817326)
【分類號】：R580

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 曹軍軍;楊茂偉;郭寶磊;梁單;;枸櫞酸鐵銨通過提高ROS水平激活MAPK通路并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[J];中國病理生理雜志;2013年03期

【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2521463