【摘要】：第一部分BMP9在小鼠下丘腦的表達(dá)和分布目的:檢測BMP9基因在普食(NCD)和高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠及db/db鼠下丘腦分布。方法:利用Western blot技術(shù)檢測普食和高脂喂養(yǎng)的12周后C57BL/6J以及普食喂養(yǎng)12周后db/db鼠(NCD組、HFD組、db/db組,均n=4)下丘腦BMP9基因表達(dá)水平。結(jié)果:高脂C57BL/6J小鼠下丘腦BMP9蛋白較普食組明顯下降(p0.05),db/db鼠下丘腦BMP9蛋白較普食組明顯下降(p0.01)。結(jié)論:高脂飲食和肥胖降低下丘腦BMP9蛋白水平。第二部分中樞性BMP9過表達(dá)對小鼠肝糖代謝影響目的:側(cè)腦室給予普食(NCD)和高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠Ad-BMP9或Ad-GFP,初步探討中樞性BMP9過表達(dá)對小鼠肝臟葡萄糖代謝的影響。方法:7周齡健康雄性C57BL/6J小鼠90只,分別適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為普食喂養(yǎng)組(ND組,n=40)和高脂喂養(yǎng)組(HFD組,n=40),均喂養(yǎng)12周。于12周末分別隨機(jī)側(cè)腦室注射Ad-BMP9或Ad-GFP,分為普食空載組(NCD+Ad-GFP組,n=20),普食BMP9病毒組(NCD+Ad-BMP9組,n=20),高脂空載病毒組(HFD+Ad-GFP組,n=20),高脂BMP9病毒組(HFD+Ad-BMP9組,n=20)。利用Western blot檢測測BMP9蛋白表達(dá)水平。測定空腹/餐后血糖、攝食及體重變化、血壓、血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、呼吸商等,利用腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)、胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)、高胰島素-正葡萄糖鉗夾及組織葡萄糖攝取試驗(yàn)評價(jià)各組小鼠肝糖代謝、胰島素敏感和組織葡萄糖攝取能力變化。結(jié)果:普食組給予Ad-BMP9后下丘腦BMP9蛋白水平顯著升高,高脂組給予Ad-BMP9后下丘腦BMP9蛋白水平也顯著增加。NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組相比,小鼠血糖、攝食及體重、血壓、血漿TG、TC、FFA、ASL、ALT水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;HFD+Ad-GFP組較NCD+Ad-GFP組小鼠上述指標(biāo)均明顯升高(p0.05);HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠體重、攝食、餐后血糖、收縮壓、舒張壓、血漿TG、TC、FFA水平顯著升高(p0.05),但ALT、AST水平兩組相比無明顯差異。NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比,RER、VO2無明顯差異;而HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠VO2顯著升高(p0.05),RER較HFD+Ad-GFP組降低(p0.05)。在鉗夾穩(wěn)態(tài)期,NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比,葡萄糖輸入率(GIR)、葡萄糖清除率(GRd)及肝糖生成(HGP)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);而HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠GIR、GRd顯著升高(p0.01),HGP則顯著下降(p0.01)。NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比,脂肪組織和肌肉組織葡萄糖攝取無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);而HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠脂肪組織葡萄糖攝取無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),肌肉組織葡萄糖攝取顯著升高(p0.05)。結(jié)論:中樞性BMP9改善飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和降低外周肝糖產(chǎn)生。第三部分中樞性BMP9基因過表達(dá)對高脂喂養(yǎng)小鼠下丘腦相關(guān)信號通路和肝糖異生酶的影響目的:通過檢測側(cè)腦室給予的Ad-GFP或Ad-BMP9的普食和高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶和下丘腦胰島素信號通路包括胰島素受體(Ins R)、和蛋白激酶B(AKT)以及下丘腦雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K),研究中樞性BMP9基因過表達(dá)對下丘腦胰島素信號通路及mTOR信號通路和肝臟糖異生酶的影響。方法:20只C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為普食喂養(yǎng)組(NCD組,n=10)和高脂喂養(yǎng)組(HFD組,n=10),均喂養(yǎng)12周。于12周末分別隨機(jī)側(cè)腦室注射Ad-BMP9或Ad-GFP,分為普食空載組(NCD+Ad-GFP組,n=5),普食BMP9病毒組(NCD+Ad-BMP9組,n=5),高脂空載病毒組(HFD+Ad-GFP組,n=5),高脂BMP9病毒組(HFD+Ad-BMP9組,n=5);利用實(shí)時(shí)的熒光定量PCR檢測各組小鼠側(cè)腦室給予腺病毒后第7天下丘腦NPY、Ag RP、POMC的m RNA,利用Western blot檢測下丘腦Ins R、AKT、mTOR、p70S6K和肝臟PEPCK、G6Pase的蛋白表達(dá),利用免疫組化各組小鼠下丘腦c-fos水平。利用免疫熒光檢測各組在基礎(chǔ)狀態(tài)下和胰島素刺激下下丘腦弓狀核PIP3的形成情況。結(jié)果:NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比,下丘腦NPY、Ag RP、POMC的m RNA表達(dá)均無明顯差異(p0.05);HFD+Ad-BMP9組小鼠下丘腦NPY m RNA表達(dá)顯著低于HFD+Ad-GFP組(p0.01),下丘腦POMC m RMA顯著高于HFD+Ad-GFP(p0.01),而下丘腦Ag RP m RNA兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比下丘腦Ins R、AKT、mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平及肝臟PEPCK、G6Pase m RNA和蛋白水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);HFD+Ad-BMP9組小鼠下丘腦Ins R、AKT、p70S6K蛋白磷酸化水平顯著高于HFD+Ad-GFP組(p0.05或p0.01),肝臟PEPCK、G6PAse m RNA和蛋白水平均顯著低于HFD+Ad-GFP組(p0.05或p0.01)。NCD+Ad-BMP9組和NCD+Ad-GFP組小鼠下丘腦有c-fos表達(dá),以室旁核最為密集,但兩組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);HFD+Ad-BMP9組小鼠下丘腦室旁核Fos免疫反應(yīng)性陽性神經(jīng)元數(shù)目較HFD+Ad-GFP組顯著增加,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。高脂飲食下,在基礎(chǔ)狀態(tài)下,Ad-BMP9組與Ad-GFP組下丘腦ARC的中度和高度PIP3形成有所增加,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)(p0.05),而在胰島素刺激下,Ad-BMP9組較Ad-GFP組下丘腦ARC的PIP3形成明顯增加(p0.05)。結(jié)論:在普食狀態(tài)下,中樞性BMP9基因過表達(dá)對小鼠下丘腦胰島素信號通路、肝臟糖異生酶和下丘腦mTOR信號通路無明顯影響;在高脂飲食下,小鼠下丘腦胰島素信號通路及PIP3分子激活及肝臟糖異生增加,下丘腦mTOR通路激活,中樞性BM9基因過表達(dá)可以激活下丘腦胰島素信號通路和抑制肝糖糖異生,調(diào)節(jié)mTOR通路,激活c-fos活性,增加PIP3的形成。第四部分中樞性BMP9通過mTOR通路改善高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗目的:探討中樞性BMP9基因過表達(dá)改善下丘腦胰島素抵抗和肝糖產(chǎn)生是否依賴于下丘腦mTOR通路方法:40只高脂喂養(yǎng)12周的C57BL/6J小鼠,構(gòu)建右側(cè)腦室微量給藥系統(tǒng),隨機(jī)分為HFD+Ad-GFP組(n=20)和HFD+Ad-BMP9組(n=20),第7d禁食6h通過側(cè)腦室給藥系統(tǒng)注射雷帕霉素(Rapamycin,20ug/2ul)和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO,分組為:Ad-GFP+DMSO組(n=10),Ad-GFP+rapamycin組(n=10),Ad-BMP9+DMSO組(n=10),Ad-BMP9+rapamycin組(n=10)。利用葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)評價(jià)各組小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性變化。利用PCR檢測肝臟PEPCK和G6Pase m RNA水平,利用Western blot檢測下丘腦mTOR、p70S6K和肝臟PEPCK、G6Pase的蛋白表達(dá)。結(jié)果:葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)中,Ad-BMP9+DMSO組較Ad-GFP+rapamycin組、Ad-GFP+DMSO組和Ad-BMP9+rapamycin組小鼠血糖和曲線下面積顯著減少(p0.05)。Ad-BMP9+DMSO組小鼠下丘腦mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平表達(dá)顯著高于Ad-GFP+rapamycin組、Ad-GFP+DMSO組和Ad-BMP9+rapamycin組(p0.05或p0.01),肝臟PEPCK、G6Pase m RNA和蛋白水平均顯著低于HFD+Ad-GFP組、Ad-GFP+rapamycin組、Ad-GFP+DMSO組和Ad-BMP9+rapamycin(p0.05或p0.01)。結(jié)論:中樞性BMP9基因過表達(dá)可通過下丘mTOR通路改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟胰島素抵抗和降低肝臟糖異生,增強(qiáng)胰島素敏感性。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

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本文編號：2513415