【摘要】：第一部分：胰腺星狀細胞促進高糖誘導的胰島p細胞損傷目的近期研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病(T2DM)患者和動物模型的胰島中存在活化的胰腺星狀細胞(PSC)。PSC在一些胰腺疾病如慢性胰腺炎和胰腺癌中的致胰腺纖維化作用已被大量研究證實,但其在胰腺內(nèi)分泌所起作用尚未明確。本研究擬通過體內(nèi)、外實驗來觀察PSC對胰島β細胞功能及活力的影響。方法常規(guī)胰腺組織塊培養(yǎng)法分離wistar大鼠PSC,體外培養(yǎng)純化至4-5代后,通過胰腺多點移植的方式植入正常血糖的wistar和自發(fā)性T2DM Goto-Kakizaki (GK)大鼠體內(nèi)。未干預組和假手術(shù)組作為本實驗的對照組(wistar大鼠未干預組、假手術(shù)組及移植組分別記為WU、WS、WT; GK大鼠未干預組、假手術(shù)組及移植組記為GU, GS、GT)。移植后密切監(jiān)測血糖,移植16周后口服糖耐量試驗(OGTT)檢測各組大鼠血糖和葡萄糖刺激的胰島素釋放水平,并計算血糖和胰島素曲線下面積。糖化血紅蛋白(HbA1c)試紙檢測HbAlc水平：胰腺組織切片行胰島素免疫熒光染色觀察胰島形態(tài)并比較胰島β細胞量：TUNEL和胰島素免疫熒光共染觀察胰島p細胞凋亡；馬松染色評估胰島纖維化。體外研究采用PSC培養(yǎng)上清(PSC-CM)及高糖(HG組,葡萄糖濃度：25mmol/l)干預INS-1大鼠胰島p細胞系,CCK-8試劑盒檢測INS-1細胞活力；Annexin V/PI流式細胞分析檢測INS-1細胞凋亡; western blot和real-time PCR檢測INS-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER-stress)相關(guān)蛋白CHOP mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果1.大鼠隨機分組后監(jiān)測基線水平胰島功能,wistar大鼠三組間和GK大鼠三組間OGTT各點血糖值無統(tǒng)計學差異。移植16周后OGTT示GK大鼠糖負荷后30mmin血糖明顯升高(GT:30.1±4.5 mmol/1 vs. GU:22.4±4.1 mmol/l 和 GS:23.2±1.9 mmol/1, P0.05),血糖曲線下面積增多(GT:2953.2±296.1 mmol/l·min vs. GU:2474.4±374.1 mmol/1·min 和 GS:2525.4±273.3 mmol/l·min, P0.05);空腹及糖負荷30 min血漿胰島素水平下降(0min：GT:54.0±21.1 pg/ml vs.GU:94.8±73.8 pg/ml和GS:126.5±37.1 pg/ml,P0.05; 30min:GT:85.7±49.5 pg/ml vs. GU:128.7±74.3 pg/ml和GS:91.6±30.5 pg/ml, P0.01),相應的胰島素曲線下面積下降(GT:8259.2±2345.8 pg/ml-min vs. GU:21364.9± 8173.4pg/ml-min和GS:19245.7±4191.9pg/ml·min, P0.05), GK大鼠移植組HbA1c升高(GT：9.8±1.4%vs.GU：8.8±1.0%和GS：8.5±1.0%,P0.05)。2.免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSC移植后GK大鼠胰島形態(tài)受損更為嚴重,β細胞量減少(GT：0.09±0.03vs.GU：0.13±0.05和GS：0.12±0.06,P0.05),胰島纖維化增加(GT：0.30±0.07vs.GU：0.22±0.08和GS：0.23±0.04,P0.05)。3.PSC移植后wistar大鼠WT、WU及WS三組間血糖、胰島素及相應的曲線下面積、HbA1c、胰島β細胞量及胰島纖維化程度沒有統(tǒng)計學差異。4.體外研究結(jié)果示和對照組相比,PSC-CM和HG單獨干預都顯著降低INS-1細胞活力,而在HG基礎上添加PSC-CM干預損傷效應最明顯(CCK-8檢測的各組吸光度值：Control:1.02±0.02 vs. PSC-CM:0.92±0.02、HG:0.91±0.03及PSC-CM+HG：0.88+0.05,p均0.01)5.Annexin V/PI流式結(jié)果示四組凋亡水平分別為Control:1.7±1.2%、PSC-CM:10.5±1.1%、HG:13.7±0.5%及PSC-CM+HG:28.0±0.8%, (p 0.01)。6. western blot和real-time PCR結(jié)果示PSC-CM和HG明顯上調(diào)CHOP的表達,共同干預組上調(diào)最顯著。結(jié)論PSC移植導致GK大鼠血糖及HbAlc水平升高,胰島素釋放降低,胰島β細胞量減少,胰島纖維化及p細胞凋亡增加,表明PSC移植進一步加重了GK大鼠胰島p細胞功能損傷,而wistar大鼠移植后未產(chǎn)生顯著影響。體外高糖和PSC上清降低INS-1細胞活力,增加凋亡,增加CHOP的表達,提示PSC可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激進一步加重高糖對p細胞損傷。第二部分：大鼠胰島星狀細胞對胰島β細胞的影響目的大量研究已經(jīng)證實慢性胰腺炎、胰腺癌等疾病中出現(xiàn)的胰腺纖維化是由胰腺星狀細胞(PSC)引起,但是2型糖尿病病程晚期出現(xiàn)的胰島纖維化細胞學機制尚未完全明確。本研究應用改良的PSC的分離技術(shù),從正常大鼠胰島內(nèi)分離星狀細胞(ISC),并對其生物學特性加以鑒定,檢測其對胰島β細胞功能的影響方法胰腺組織外生培養(yǎng)技術(shù)常規(guī)分離PSC作為對照,本研究嘗試采用胰島貼壁培養(yǎng)法分離ISC,油紅O及免疫熒光染色分別觀察脂滴和平滑肌肌動蛋白-α(α-SMA)的表達來評估細胞活化狀態(tài),α-SMA、波形蛋白(vimentin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)用來鑒定ISC,免疫熒光檢測細胞外基質(zhì)(ECM)成分Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維(col-Ⅰ、col-ⅢⅢ)和纖維連接蛋白(FN)表達。CCK-8、劃痕試驗和transwell小室試驗分別用來比較PSC和ISC在增殖、遷移能力的差別。通過非接觸式共培養(yǎng)及ISC-上清(ISC-CM)協(xié)同高糖(25mmol/l)干預INS-1細胞,CCK-8實驗觀察ISC及高糖對INS-1細胞活力的影響,并通過脫細胞技術(shù)進一步分離ISC來源ECM與胰島共培養(yǎng),caspase-3活性試劑盒及FDA/PI共染檢測胰島細胞凋亡,更深一步分析其對胰島細胞活力的影響。結(jié)果在細胞培養(yǎng)皿經(jīng)過培養(yǎng)24 h后,胰島貼壁,48 h內(nèi)可見外形呈現(xiàn)多角形如星狀的細胞自胰島邊緣外生。和靜息狀態(tài)PSC同步比較,ISC脂滴含量明顯量少,且快速消失,隨之表達α-SMA。傳代活化后的ISC表達PSC的鑒定指標α-SMA、vimentin和GFAP,并且表達col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN,為了和PSC區(qū)別,暫時將此類細胞稱為胰島星狀細胞。體外培養(yǎng)12h、36h及72h后CCK-8實驗各組OD值示ISC增殖能力明顯弱于PSC(0.15±0.01、0.30±0.01、0.44±0.01 vs.0.15±0.01、0.25±0.02、0.37±0.02；12h,p0.05,余p0.01),劃痕實驗示24h后]SC遷移入無細胞區(qū)域的細胞量明顯少于PSC(33.8±7.9vs.129.2±8.8,p0.01),transwell小室遷移實驗示24h后穿過小室膜的ISC少于PSC(21.2±5.1 VS 50.0+10.2,p0.01)。INS-1細胞經(jīng)ISC非接觸式共培養(yǎng)及ISC-CM干預后CCK-8檢測OD值降低,提示細胞活力下降,而在高糖共同干預下,破壞效應最為明顯。通過脫細胞技術(shù)分離大鼠ISC-ECM,干預INS-1細胞24h后caspase-3活性檢測OD值增加(339074.6±49799.2 vs.104809.1±2837.6,p0.01),ECM與胰島共培養(yǎng)后胰島形態(tài)破壞,FDA/PI染色示幾乎100%細胞呈現(xiàn)PI陽性細胞。結(jié)論本次實驗成功從新鮮分離的大鼠胰島提取出星狀細胞,這類ISC具有靜息和活化兩種狀態(tài),活化狀態(tài)ISC可表達α-SMA、vimentin及GFAP,合成細胞外基質(zhì),具有星狀細胞基本特性。但是其增殖和遷移能力明顯弱于PSC。ISC可誘導胰島細胞功能及細胞活力下降,尤其在高糖參與下?lián)p傷效應更明顯,進一步分離的ISC-ECM可顯著導致胰島細胞受損。第三部分：人胰島星狀細胞對胰島功能的影響目的前期研究從新鮮分離的大鼠胰島中成功分離了胰島星狀細胞(ISC),這些細胞與經(jīng)典的胰腺星狀細胞(PSC)表型類似,可能參與2型糖尿病(T2DM)胰島纖維化的發(fā)生。由于人和大鼠間存在種屬差異,本研究將進一步嘗試從人胰島中分離星狀細胞,并觀察人ISC對胰島功能的影響。方法通過標準的組織塊外生培養(yǎng)技術(shù),我們從新鮮分離的人胰島中成功分離出ISC,同時,從人胰腺組織塊中分離了胰腺星狀細胞(PSC)作為本實驗的對照。平滑肌激動蛋白-α(α-SMA)、結(jié)蛋白(desmin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色鑒定人ISC, CCK-8試驗用來比較人ISC和PSC增殖速度差異,劃痕實驗及transwell小室遷移試驗用來比較ISC和PSC的遷移能力,Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及纖維連接蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN)免疫熒光染色觀察ISC分泌細胞外基質(zhì)(ECM)的能力。為了觀察人ISC對胰島功能及細胞活力的影響,我們將新鮮分離的人胰島與體外培養(yǎng)活化后的ISC接觸式共培養(yǎng),葡萄糖刺激胰島素釋放試驗檢測胰島素釋放功能,caspase-3活性試劑盒檢測胰島細胞凋亡。進一步脫細胞技術(shù)分離人ISC-ECM干預人胰島,FDA/PI雙染觀察胰島細胞活力。結(jié)果貼壁培養(yǎng)的人胰島外生細胞眾多星狀細胞,傳代活化人ISC免疫熒光可見α-SMA、 desmin、vimentin、GFAP染色,表達col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN。與PSC相比,人ISC增殖顯著降低(24h、48h及72h三點CCK-8實驗所測OD值：ISC 0.63±0.01、0.80±0.01及0.99±0.02 vs.0.65±0.05、1.03±0.02及1.40±0.01,24h點兩組p0.05,余對比p0.01)。劃痕實驗示ISC 24h后遷移入無細胞區(qū)的細胞量較PSC明顯減少(19.0±5.5 vs.51.8±10.2,p0.01), Transwell小室遷移實驗示24h后ISC穿膜的細胞數(shù)較PSC明顯減少(25.0±5.6vs.208.7±28.0,p0.01)。人ISC與胰島接觸式共培養(yǎng)后,葡萄糖刺激實驗檢測胰島功能,2mmol/l及20mmol/l葡萄糖刺激下人胰島的胰島素釋放水平均增強(0.8±0.2ng/islet/h vs. 4.111.5 ng/islet/h; 1.3±0.3 ng/islet/h vs.9.8±3.3 ng/islet/h, p0.05),而各組胞內(nèi)胰島素含量無統(tǒng)計學差異。Caspase-3活性試劑盒檢測OD值示兩組無統(tǒng)計學差異。進一步分離的人ISC-ECM免疫熒光染色觀察到Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN的表達,ISC-ECM與胰島共培養(yǎng)后,明顯引起胰島形態(tài)破壞,FDA染色可見少量細胞陽性,幾乎100%細胞呈現(xiàn)PI陽性細胞。結(jié)論本次實驗成功從新鮮分離的人胰島提取出星狀細胞,活化狀態(tài)ISC可表達a-SMA. desmin、vimentin及GFAP,合成細胞外基質(zhì),具有星狀細胞基本特性。但是其增殖和遷移能力明顯弱于PSC。人ISC與胰島接觸式共培養(yǎng)后胰島功能得到部分改善,但進一步分離的ISC-ECM可顯著導致胰島細胞死亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
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本文編號：2473711