【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和滑膜異常增生為特點(diǎn),從而侵蝕鄰近的軟骨和骨組織,最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)損傷,為人類最常見的自身免疫性疾病之一。大量的實(shí)驗(yàn)指出,異常增殖活化的成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),可分泌多種炎癥介質(zhì),從而引起滑膜損傷,是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。因此,通過抑制FLS細(xì)胞的活化增殖是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。文獻(xiàn)提示,Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)控制著許多細(xì)胞生物過程,其中包含細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等。其中,經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在肝癌,宮頸癌,胃癌,黑色素瘤等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其明顯的作用。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)是一種細(xì)胞外的一種分泌性蛋白,同時(shí)它也是Wnt信號(hào)通路上游的一種拮抗劑。在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),SFRP2在甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)催化下,自身可發(fā)生甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)顯著降低,從而激活經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中SFRP2是否發(fā)生甲基化從而激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)FLS細(xì)胞的異常增殖,還未見文獻(xiàn)報(bào)道。越來越多的文獻(xiàn)表明中藥在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療方面起著至關(guān)重要的作用。橙皮素(Hesperidin,HDN)是一種黃酮類化合物,主要存在于柑橘類水果中。它也是傳統(tǒng)中藥陳皮的主要成分。已知黃酮類化合物,包括HDN,具有多種生物學(xué)功能,例如抗炎、抗風(fēng)濕、抗病毒和抗癌等生物活性。因此,本課題組前期合成并改進(jìn)了一些橙皮素衍生物,實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)橙皮素衍生物11(HDND-11)可抑制滑膜細(xì)胞增殖,通過MTT實(shí)驗(yàn)檢發(fā)現(xiàn)HDND-11對(duì)FLS細(xì)胞的增殖和活化有顯著地抑制作用,并可促進(jìn)SFPR2的表達(dá)。那么HDND-11對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是否有治療作用,其作用機(jī)制是否與促進(jìn)SFRP2的表達(dá)有關(guān),本實(shí)驗(yàn)就此問題進(jìn)行了研究。本課題以AA大鼠模型為對(duì)象,研究HDND-11對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其可能的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)分以下6個(gè)部分。1、HDND-11對(duì)AA大鼠模型的治療作用。雄性SD大鼠通過右后足趾皮內(nèi)注射完全佐劑(CFA),建立AA大鼠模型。通過HE染色、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、足腫脹評(píng)分以及ELISA檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)的炎癥程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HDND-11對(duì)關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療效果。2、HDND-11抑制大鼠FLS的增殖的研究。通過用MTT方法,檢測(cè)0,12.5,25,50,100,200μM六個(gè)不同濃度的HDND-11作用FLS細(xì)胞48h以及使用HDND-11(100μM)分別作用FLS細(xì)胞6h,12h,24h和48h,從而判斷HDND-11對(duì)FLS細(xì)胞的增殖的影響。此外,采取流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HDND-11對(duì)FLS細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HDND-11能夠顯著地抑制FLS細(xì)胞的增殖。3、HDND-11促進(jìn)AA大鼠滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)的研究。通過用免疫組化、Western blot以及RT-q PCR方法檢測(cè)滑膜組織中SFRP2的表達(dá),用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測(cè)FLS中SFRP2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組相比較,AA滑膜組織和AA-FLS中SFRP2的表達(dá)顯著降低,且HDND-11能夠顯著促進(jìn)模型組滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)。4、SFRP2對(duì)FLS細(xì)胞增殖的研究。鑒于SFRP2在AA-FLS細(xì)胞中低表達(dá),本文采用脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-SFRP2作用于AA-FLS細(xì)胞,用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測(cè)FLS中SFRP2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SFRP2過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)方法檢測(cè)過表達(dá)的SFRP2對(duì)AA-FLS增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)的SFRP2能夠顯著抑制AA-FLS的增殖。5、HDND-11促進(jìn)AA大鼠滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2表達(dá)機(jī)制的研究。用Western blot以及RT-q PCR方法檢測(cè)滑膜組織中DNMT1的表達(dá),用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測(cè)FLS中DNMT1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組相比較,AA滑膜組織和AA-FLS中DNMT1的表達(dá)顯著升高,且HDND-11能夠顯著抑制模型組滑膜組織和FLS細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)。用Western blot和RT-q PCR兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)DNMT1對(duì)SFRP2蛋白及RNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,沉默DNMT1基因的表達(dá)能夠顯著升高SFRP2基因的表達(dá)。6、HDND-11、SFRP2以及DNMT1對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響。通過Western blot檢測(cè)HDND-11對(duì)滑膜組織及FLS細(xì)胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HDND-11能夠顯著抑制滑膜組織及FLS細(xì)胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表達(dá),即HDND-11能夠抑制Wnt信號(hào)通路。通過Western blot檢測(cè)過表達(dá)的SFRP2和沉默的DNMT1對(duì)FLS細(xì)胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三種Wnt信號(hào)下游效應(yīng)基因的表達(dá)的影響。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)的SFRP2和沉默的DNMT1能夠顯著抑制FLS細(xì)胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三種基因的表達(dá),即高表達(dá)的SFRP2基因和低表達(dá)的DNMT1基因能夠抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Cheng Xu;Xiang-Hua Zeng;Li Wang;Shi-Qi Tao;Quan-Xin Wu;Peng Zhu;Guo-Hong Deng;Yu-Ming Wang;;sFRP-4, a potential novel serum marker for chronic hepatitis B-related hepatocellular carcinoma[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2015年02期

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本文編號(hào)：2473384