發(fā)布時間：2019-04-16 17:17

【摘要】：目的： 最近的研究證明了成骨細胞分泌的不同形式的骨鈣素在骨骼與胰島交聯作用中的地位，使得骨骼與胰腺之間相互調控和作用越來越受到關注，因此胰島素在代謝性骨病發(fā)病機制中的地位再次成為熱點。我們以往的研究已經明確了代謝性骨病之一的氟骨癥主要在氟骨癥發(fā)病過程中成骨細胞和破骨細胞表現出程度不同的活躍。成骨細胞功能活躍在氟骨癥病變中是一個起主導作用的環(huán)節(jié)。該課題的主要目的是考察氟骨癥這些特征性改變與胰島素對骨轉換的調控是否聯系，并闡明胰島素在氟中毒誘導的骨病變以及體外染氟成骨細胞的刺激作用的地位。 方法及結果： 采用灌胃給氟2月復制氟骨癥模型，并在染氟1月后經腹腔注射一次STZ來抑制胰島素的分泌。結果顯示投氟大鼠氟斑牙特征明顯，而且隨著投氟劑量的升高，氟斑牙由半透明出現條紋到牙齒呈白堊色；而且STZ聯合氟處理組大鼠牙齒破環(huán)較相同投氟組明顯，尤其是高氟出現了牙齒缺損和斷裂。利用生化方法分析的胰島素、胰島素敏感性、血糖和HbA1C水平，結果表明了投氟明顯刺激了胰島素的分泌，相應地血糖和HbA1C水平變化不明顯。聯合STZ處理組大鼠的胰島素在低氟組是升高的，高氟組未觀察到降低；然而STZ處理大鼠明顯影響了胰島素的降糖功能。胰島素敏感實驗反應了機體的胰島素效能，從血糖的變化趨勢可見投低劑量氟和聯合STZ處理引起的血糖回歸正常延時很可能歸于一定劑量的氟能降低胰島素的敏感性甚至引起胰島素抵抗發(fā)生。采用免疫組化檢測胰島內胰島素和骨鈣素受體GPRC6A蛋白表達情況，發(fā)現投氟刺激了胰島素的分泌，而且高氟組大鼠的胰島素分泌能力提高更顯著。單獨STZ處理抑制了胰島素分泌，聯合氟處理大鼠后仍然刺激了胰島素的表達。進一步骨密度和骨鈣素水平的分析顯示了隨著投氟量的增加，骨密度下降更明顯；STZ處理加重了骨密度的下降，且投氟越高骨密度下降越明顯。單獨氟處理大鼠輕度誘導了GPRC6A的蛋白表達，而聯合STZ處理后投氟反而引起了該受體的表達下降。骨鈣素僅在給予高氟條件下輕度升高，聯合應用STZ處理組后各投氟組間骨鈣素變化不顯著。鑒于OCN與GPRC6A之間的關系，可見氟能夠輕度刺激GPRC6A表達和提高血液中的骨鈣素含量。聯系前面觀察到的氟明顯刺激胰島素的分泌；同時，STZ及聯合氟作用降低了胰島素的敏感性，影響GPRC6A在胰島內的表達導致其下降。利用定量PCR技術分析了投氟或聯合STZ處理組大鼠成骨、破骨標志及相關調控基因的變化。結果顯示出低量氟明顯誘導成骨細胞早期分化，高劑量氟對誘導分化作用不明顯。STZ聯合投氟處理明顯抑制了成骨早期分化，但對成骨晚期分化有一定作用。投氟顯著刺激了破骨細胞的功能，STZ降低了破骨細胞的功能，而且聯合投氟破骨作用不明顯。破骨調控因子的變化顯示了投氟顯著刺激了破骨和骨吸收。STZ處理并沒有明顯抑制破骨相關基因的表達，但是聯合投氟顯著促進OPG表達和降低RANKL基因，說明了兩者聯合應用抑制了破骨活性。TGFβ、β-catenin和Wnt10的基因變化說明了TGFβ在氟誘導成骨和破骨過程中起到重要作用，而且在STZ誘導的胰島素敏感性下降而導致氟誘導成骨晚期分化和破骨過程中起到一定作用。而β-catenin和Wnt10主要參與了氟作用下引起成骨、破骨活性改變，，STZ聯合氟處理一定程度抑制了大鼠骨組織β-catenin的表達，主要體現了成骨受抑制而引起其表達。 利用出生三周的Wistar小鼠股骨和脛骨收集骨髓間充質干細胞進行成骨細胞分化實驗觀察。選取穩(wěn)定和細胞種類純化的第三代的BMSC，礦化液孵育28天后茜素紅S染色，觀察到細胞出現融合和多層細胞疊加呈紫色或粉色的團塊,說明了本實驗收集的BMSC傳至第三代后主要是由成骨潛能的干細胞組成,從而為下面的成骨誘導實驗提供依據。染氟或胰島素處理細胞能夠刺激BMSC活性，而且胰島素聯合在低、中劑量氟作用下加強了細胞活性，但是胰島素聯合高劑量氟加重抑制了細胞活性，體現了胰島素對成骨增生作用與氟刺激成骨作用一致。通過改良鈣-鈷法進行堿性磷酸酶染色，觀察分化細胞早期情況。低、中劑量染氟明顯刺激了BMSC細胞早期分化，但是高量氟顯著抑制了該細胞的分化；聯合胰島素處理BMSC細胞也是呈現低、中劑量氟的刺激作用和高劑量氟對細胞早期成骨分化的抑制作用，這種協(xié)同作用主要體現在高劑量氟對ALP的抑制作用。 利用MC3T3-E1細胞作為體外成骨細胞前體染氟模型。通過不同劑量氟和胰島素對該細胞增殖活性的影響，確定了能夠誘導成骨細胞活性的染氟濃度1、2、8mgF-/L和50nmmol/L為細胞實驗條件。為了觀察胰島素受體對染氟成骨細胞的誘導成骨和破骨活性的影響，我們采用基因干擾（siRNA）有效降低了胰島素受體在成骨細胞內的表達。采用CCK-8方法觀察了從低到高劑量氟聯合胰島素作用對成骨細胞活性的影響。結果顯示出染氟對MC3T3-E1細胞活性的影響主要集中在低和中劑量氟處理組，胰島素不僅本身刺激成骨細胞活性，而且能夠加強氟刺激成骨細胞活性的作用。定量聚合酶鏈式反應分析了成骨細胞內胰島素受體底物及與骨鈣素調控胰島素分泌密切相關因子Esp和FoxO1，結果顯示出胰島素受體有效抑制后，明顯降低了胰島素受體底物，但顯著激發(fā)了Esp基因的表達；聯合染氟后不同程度地誘導了胰島素受體的基因表達和激活胰島素受體底物的表達，相應地降低了Esp基因。說明了氟能夠顯著刺激胰島素受體的表達并通過胰島素受體底物和Esp基因信號通路相互協(xié)調發(fā)揮其調控成骨細胞的作用。進一步定量分析了染氟成骨細胞內成骨和破骨調控因子在胰島素受體表達受抑制后的表達變化。胰島素受體主要影響成骨轉錄因子osterix和骨鈣素發(fā)揮刺激成骨作用，而MAPK信號通路參與胰島素調控的成骨活性過程。另一方面，破骨細胞分化調控因子的變化說明了胰島素受體主要通過調控OPG基因的表達變化發(fā)揮調控破骨細胞分化作用。 結論: 通過體內外實驗結果我們發(fā)現氟斑牙病變程度隨著投氟量的增加而加重，鏈尿佐菌素抑制胰島素分泌加重氟中毒癥狀。氟能夠輕度刺激GPRC6A表達和提高血液中的骨鈣素含量，明顯刺激胰腺分泌胰島素作用。不同濃度氟作用大鼠可引起胰島素敏感性的變化。鏈尿佐菌素（STZ）抑制大鼠胰島素降糖效應，同時也導致胰島素敏感性下降引起胰島素抵抗,造成機體各器官對胰島素調控作用不敏感。投氟誘導大鼠骨密度下降，且投氟越高骨密度下降。聯合成骨和破骨標志物和基因的變化，說明了給氟激發(fā)了大鼠股骨活躍的骨轉換。大鼠胰島素活性和敏感性下降明顯影響了成骨細胞和破骨細胞分化和進一步加重骨病變。TGFβ在氟誘導成骨和破骨過程中起到重要作用，而且參與了胰島素對氟誘導的骨轉換發(fā)生調控機制。氟通過調控β-catenin和Wnt10途徑發(fā)揮調控成骨、破骨活性作用。體外實驗驗證了一定劑量氟刺激骨髓間充質細胞和成骨前體細胞的增生和誘導骨髓間質干細胞分化；胰島素刺激兩種細胞細胞增生，但誘導成骨細胞早期分化作用不明顯。胰島素主要通過胰島素受體介導胰島素受體底物和Esp基因參與氟誘導的成骨和破骨活性變化。胰島素主要影響了成骨分化后期osterix和骨鈣素的表達來參與氟誘導的成骨作用；同樣地，它也是主要通過對OPG的表達來參與氟誘導的破骨作用。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R599.1

【參考文獻】

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本文編號：2458952