【摘要】：隨著飲食及生活方式的轉變,糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤和心腦血管病之舌威脅人類健康的主要疾病,它可以導致心、腦、腎等多器官損害,并已戎為患者致死致殘的主要原因。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)公布最新統(tǒng)計顯示,2011年全球糖尿病患者大約有3.66億,而到2030年,這一數(shù)字將達到.52億。我國2007-2008年糖尿病流行病學調查顯示,糖尿病患病人數(shù)達到9720萬,而糖尿病前期患病人數(shù)更是達到了1.45億。而最新調查顯示糖尿病患病率已達11.7%,糖尿病患者已超過1億人。糖尿病的發(fā)生經(jīng)過糖耐量正常、糖尿病前期以及糖尿病三個階段。糖尿病前期患者是2型糖汞病的后備軍,因此研究糖尿病前期的發(fā)病機制,尋找早期預防和治療糖汞病前期的有效策略,對于提高人類的健康水平和生活質量,減少患者經(jīng)齊負擔,具有重要的意義。以往人們認為糖尿病前期的發(fā)病機制是以胰島素抵抗為主。然而近年隨著對胰島p細胞研究的增加,越來越多的學者開始認識到胰島p細胞功斃和數(shù)量的下降在糖尿病前期向2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。動物實驗表明,db/db小鼠模型在血糖升高的過程中,其胰島p細胞數(shù)量呈下降趨勢。一項流行病學調查顯示2型糖尿病患者在診斷之前10-12年胰島功能就已經(jīng)出現(xiàn)減低,并隨著血糖的升高而下降,到診斷糖尿病時胰島功能已經(jīng)減少到正常的50%左右。而許多新發(fā)現(xiàn)的糖尿病前期患者如不采取任何干預措施3年內即可能轉變成2型糖尿病,進一步的尸檢發(fā)現(xiàn)糖汞病前期的患者胰島p細胞數(shù)量大約是正常人的60%,而2型糖尿病患者則降至正常人的40%。糖尿病發(fā)病的具體機制目前仍不清楚,但人們逐漸認識到不良的飲食習慣在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。以前更多的研究集中在高葡萄糖和高脂飲食對引起糖尿病的胰島素抵抗和胰島功能的影響。而近豐關于果糖對2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的影響也逐漸引起許多研究者的注其價格下降,導致含大量果糖的飲料以及甜品的攝入量逐年增加,從而導致果糖攝入量增加。許多學者開始意識到高果糖飲食對于健康的影響。動物實驗研究表明,高果糖飲食可以導致胰島素抵抗,誘導脂質沉積,引起高甘油三酯血癥、高胰島素血癥和高尿酸血癥。因此被廣泛用于糖尿病發(fā)病機制的研究。現(xiàn)有文獻報道多集中于高果糖對胰島素抵抗的影響,而對于是否導致胰島功能的損害及其機制仍不明確。許多研究已經(jīng)證明糖脂毒性導致的應激反應,如氧化應激和內質網(wǎng)應激導致了胰島功能的下降。胰島p細胞的內質網(wǎng)用于合成大量的胰島素。胰島素抵抗狀態(tài)下,胰島素分泌量明顯增加。但持續(xù)的胰島素合成和分泌：曾加不能得到緩解就會引起p細胞的內質網(wǎng)應激。這會導致p細胞衰竭甚至死亡,數(shù)目減少,引起胰島功能進行性下降,從而使糖耐量從正常到減低最后發(fā)展成糖尿病。許多研究已經(jīng)證實,內質網(wǎng)應激在果糖導致的胰島素抵抗中起著重要的作用,但是內質網(wǎng)應激是否參與果糖導致的胰島功能下降的作用及其機制仍不明確。本研究首先觀察了糖調節(jié)受損合并高甘油三酯血癥患者胰島功能的改變,了解糖尿病前期糖脂毒性對胰島功能的作用,進一步通過觀察長期高果糖飲食導致胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性和胰島功能變化,通過檢測高果糖飲食喂養(yǎng)大鼠胰島內質網(wǎng)應激相關的凋亡通路蛋白和基因的表達觀察胰島功能的改變與內質網(wǎng)應激通路的關系,明確長期高果糖飲食是否尋致胰島功能下降以及在胰島功能損傷中的危害和發(fā)生機制,并應用內質網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)對高果糖大鼠進行干預,初步探討早期胰島功能下降的治療策略。第一部分 糖耐量減低合并高甘油三酯血癥患者胰島素敏感性和胰島功能的研究目的：觀察糖耐量減低以及合并高甘油三脂血癥患者胰島素敏感性和胰島功能的變化,探討糖尿病前期糖脂代謝紊亂對胰島素抵抗和胰島功能的影響。方法：選擇2010年1月至2011年1月于河北省人民醫(yī)院及滄州市中心醫(yī)院內分泌科門診就診患者,年齡在20-65歲之間。根據(jù)1999年國際衛(wèi)生組織(WHO)的糖耐量減低診斷標準：6.1mmol/L空腹血糖(FBG)7.0mmol/I并且葡萄糖耐量(OGTT)后7.8mmol/I糖負荷后22hBG)11.1mmol/L,i參斷為糖耐量減低(IGT)；根據(jù)美國第三次膽固醇教育計劃診斷標準：甘油三酯(TG)2.3mmol/L,診斷為高甘油三酯血癥。隨機選取IGT患者40例為(IGT組),IGT合并高甘油三酯血癥患者37例(IGT-HTG組)以及正常對照組(NGT組)40例。所有受試者均測量身高、體重計算體質量指數(shù)(BMI)檢測血FBG、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素(FPI)以及游離脂肪酸(FFA)。HOMA-IR評價胰島素抵抗,HOMA-β評價基礎胰島功能。靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)評價第一時相胰島素分泌(FPIR)、多組間比較采用完全隨機的單因素方差分析,計數(shù)資料使用X2檢驗,比較3組間各指標的差異有無統(tǒng)計學意義。采用直線相關分析明確影響胰島功能和胰島素抵抗的因素。結果：1各組一般臨床資料的比較3組間性別、年齡、BMI、TC、LDL-C、HDL-C以及血壓均無明顯差異(P0.05)；與NGT組相比,IGT組和IGT-HTG組FBG、2h-BG,HbA1。和FPI明顯升高(P0.01,P0.05),但在IGT組和IGT-HTG組之間沒有明顯差異(P0.05)；在IGT-HTG組TG和FFA明顯高于IGT組陽NGT組(P0.01,P0.05)；2各組胰島素抵抗以及胰島功能評價指標的比較IGT組和IGT-HTG組HOMA-IR顯著高于NGT組,差異具有顯著性(P0.01), IGT組和IGT-HTG組間無顯著差異(P0.05); IGT-HTG組HOMA-β顯著低于NGT組和IGT組,差異具有顯著性(P0.01),IGT組和NGT組間無顯著差異(P0.05)；NGT組的FPIR顯著高于IGT組和IGT-HTG組,具有顯著性差異(P0.01),而IGT組FPIR也顯著高于GT-HT G組,具有顯著性差異(P0.05)。3相關性研究Spearman相關性分析顯示HOMA-β與FBG(r=-0.431, P=0.008)、 HbA1c (r=-0.382, P=0.024)、FPI (r=-0.486,P=0.005)和TG (r=-0.305,P=0.034)成負相關；FPIR與2h-BG(r=-0.435,P=0.007)、HbA1c(r=-0.408, P=0.0090、FPI (r=-0.462,P=0.005)和TG (r=-0.438,P=0.006)成負相關。HOMA-IR與FBG(r=0.422,P=0.008)\2h-BG(r=0.427,P=0.007)、 HbA1c(r=0.453,P=0.006)、FPI(r=0.487,P=0.005)和TG(r=0.394,P=0.015)成正相關。提示糖脂代謝紊亂參與了胰島素抵抗和胰島功能的隕傷。結論：1 IGT患者存在胰島素抵抗和胰島功能的下降,而伴高甘油三酯血癥患者胰島素抵抗和胰島功能的下降更加明顯。2 IGT患者胰島功能下降與高血糖和高甘油三酯明顯相關,表明糖脂代謝紊亂參與了胰島素抵抗和胰島功能的損傷。第二部分 高果糖飲食對大鼠胰島功能和胰島葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)的影響目的：高果糖飲食所致的胰島素抵抗大鼠早期胰島功能的變化及其發(fā)主機制。方法：清潔級健康雄性Wistar大鼠90只,體重(180-200g),購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心控制在室溫18～26℃,相對濕度40～70%,通風干燥、安靜環(huán)境中喂養(yǎng),每日12小時光照維持,晝夜循環(huán)。適應性飼養(yǎng)—周后分為正常對照組(NC)和高果糖組(HF)分別給予正常飼料和高果糖飼料喂養(yǎng)8周后,每組各取出6只應用口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)則定血糖和血胰島素計算HOMA-IR.HOMA-β和△130/△G30評價胰島功斃,觀察8周大鼠的生化指標(血脂、血糖)。分離和純化大鼠胰島Western-blot測定葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose related protein78,GRP78)蛋白水平。結果：1兩組大鼠體重及生化指標的變化不同飲食喂養(yǎng)8周后,各組大鼠體重隨著喂養(yǎng)時間的延長均有明顯增加,但兩組間的體重無顯著差異(P0.01)。HF組空腹血糖較對照組無明顯差異(P0.01),但空腹胰島素、胰島素原以及血甘油三酯均明顯高于NC組(P均0.01)。2兩組大鼠胰島素抵抗和胰島功能的評價與NC組相比,葡萄糖負荷后HF組30min、60min血糖顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)；HF組空腹胰島素明顯升高P0.05),但胰島素分泌高峰延遲。應用HOMA-IR、HOMA-β和△I30/△△G30進一步量化評價胰島素抵抗及胰島功能顯示HF組HOMA-IR較NC組明顯升高(P0.01),反映早時相胰島素分泌功能的ΔI30/ΔG30較NC組明顯降低(P0.01),但反映基礎胰島素分泌功能的HOMA-p與NC組相比無明顯差異(P0.01)；此外,HF組空腹血胰島素原／胰島素比值較NC組明顯升高(P0.01)。表明高果糖喂養(yǎng)8周后出現(xiàn)了胰島素抵抗、胰島素的不適當分泌以及早時相胰島素分泌功能的下降。3兩組大鼠胰島GRP78蛋白的表達變化與NC組相比,HF組胰島GRP78蛋白表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。提示高果糖喂養(yǎng)大鼠8周后胰島出現(xiàn)了內質網(wǎng)應激。結論：1高果糖喂養(yǎng)8周導致Wistar大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗和早期胰島功能的下降。2高果糖喂養(yǎng)大鼠胰島功能下降可能和內質網(wǎng)應激有關。第三部分內質網(wǎng)應激及其介導的凋亡通路在高果糖飲食導致胰島功能損害中的作用研究目的：探討長期高果糖飲食對大鼠胰島p細胞凋亡影響,進一步明確為質網(wǎng)應激在其中可能的作用機制以及抑制內質網(wǎng)應激對胰島功能的改善作用。方法：自第9周開始本部分實驗。正常組(NC)18只繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng),HF組隨機分為高果糖喂養(yǎng)對照組(HF-C組)18只和高果糖喂養(yǎng)加用4-苯基丁酸(4-PBA)治療組(HF-PBA組)18只。從第9周起,HF-PBA組給予4-PBA0.5g/kg/d溶于蒸餾水中灌胃,每日一次。NC組和HF-C組給予等量的蒸餾水。4-PBA干預第8周末即實驗第16周末,禁食12小時行OGTT試驗后。以2.5%戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后打開胸腹腔心臟采血處死大鼠,血液用于測定生化指標以及胰島素和胰島素原,于無菌條件下分離并取出胰腺,于胰腺尾部留取一部分置于4%多聚甲醛固定液中,充分固定以備進行TUNEL凋亡測定,一部分切成1mm長,置于2%戊二醛固定液備送電鏡標本；剩余胰腺組織勻漿用于測定胰腺內TG含量。剩余大鼠胰腺組織用于提取胰島細胞,-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR (Real-time PCR方法檢測胰島XBP-1smRNA的表達。Western blot方法檢測胰島內磷酸化的PERK.IRE1a、 eIF2a、JNK蛋白以及凋亡蛋白CHOP、Bcl-2、Bax和caspase-12的表達。結果：1大鼠體重的變化喂養(yǎng)16周后,各組大鼠體重隨著喂養(yǎng)時間的延長均有增加,HF-C組大鼠體重雖然略高于NC組和HF-PBA組,但三組間無顯著差異(P0.01)。2大鼠空腹血糖、胰島素以及胰島素原的變化喂養(yǎng)16周后,HF-C組空腹血糖較NC組和HF-PBA組略有升高,但三組間仍無顯著性差異；HF-C組空腹胰島素、胰島素原繼續(xù)升高,明顯高于NC組(P0.01),經(jīng)4-PBA治療后空腹胰島素及胰島素原都明顯下降P0.01)。3大鼠糖負荷后血糖及胰島素的變化與NC組相比,葡萄糖負荷后高果糖組30min、60min血糖進一步升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)；應用HOMA-IR、△130／△G30陽HOMA-β進一步量化評價胰島素抵抗及胰島功能顯示,HF-C組HOMA-IR較對照組明顯升高(P0.01),胰島素原/胰島素、△130/ΔG30 陽HOMA-β三項反映胰島功能的指標較NC組均進一步下降(P均0.01),表明繼續(xù)高果糖喂養(yǎng)8周后出現(xiàn)了胰島素抵抗的加重和胰島功能的進一步下降。給予4-PBA治療8周后,HF-PBA組30min和60min血糖明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)；與HF-C組相比,HF-PBA組HOMA-I R明顯下降,胰島素原/胰島素、△130/△G30和HOMA-p均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.01)。4血及胰腺組織TG的變化與NC組相比,HF-C組血及胰腺組織勻漿TG明顯增高(P均0.01),給予4-PBA治療8周的HF-PBA組血及胰腺組織勻漿TG明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.01)。5 TUNEL技術測定胰島p細胞凋亡率的變化采用TUNEL試劑盒對各組胰島凋亡細胞內DNA斷段的末端進行標記 ,凋亡細胞的核染成棕褐色。HF-C組與NC組相比有大量TUNEL陽性細胞分布,分別為(38+4.2)%vs(10+1.1)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；與HF-C組相比HF-PB組TUNFL陽性細胞明顯減少(15±1.8)%.差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6胰島細胞電鏡下的形態(tài)學變化透射電鏡下,在NC組可見細胞核呈卵圓形,核仁清晰,核染色質均勻。胞質內可見結構正常的粗面內質網(wǎng),分泌顆粒呈圓形,期內可見電子密度致密芯,外有界膜包裹,芯與界膜之間存在間隙。胞漿內還可見散在線粒體。而在HF-C組出現(xiàn)胰島細胞胞漿疏松,呈脫顆粒狀態(tài),成熟分泌顆粒減少,未成熟分泌顆粒增加。線粒體腫脹,內質網(wǎng)擴張。核周邊染色質凝聚。4-PBA治療后在HF-PBA組可見成熟分泌顆粒增多,線粒體腫脹以及內質網(wǎng)擴張改善。74-PBA對內質網(wǎng)應激通路蛋白和基因表達的影響與NC組相比,HF-C組GRP78蛋白表達進一步升高,差異有顯著性P0.01);內質網(wǎng)應激信號通路中上游調節(jié)蛋白PERK的磷酸化蛋白(p-PERK)明顯增加(P0.01),其下游因子eIF2a的磷酸化(p-eIF2a)亦明顯增加(P0.01)；另一條通路的上游調節(jié)蛋白IRE-1a的磷酸化(p-IRE-1a)明顯增加(P0.01),而與HF-C組相比,給予4-PBA干預后HF-PBA組PERK及其下游因子eIF2a, IRE1a的磷酸化蛋白表達均明顯下降,均有顯著性差異(P均0.01)。與NC組相比,HF-C組胰島XBP-1的剪切形式XBP-1 s的mRNA水平顯著增加,給予4-PBA干預大鼠XBP-1 s的mRNA水平下降,與HF-C組相比差異有顯著性(P0.01)。提示IRE1a激活了下游的XBP-1,導致XBP-1剪切進而引起ERS,而4-PBA通過IRE1a-XBP-1信號途徑減少了ERS。8 4-PBA對內質網(wǎng)應激介導的凋亡通路蛋白表達的影響進一步檢測3組內質網(wǎng)應激介導的凋亡標志物CHOP、caspase-12和JNK的磷酸化(p-JNK),以及凋亡抗凋亡調節(jié)因子Bc1-2,Bax的蛋白表達發(fā)現(xiàn),與NC組比較,HF-C組CHOP、caspase-12、p-J NK以及bax蛋白表達明顯增加,差異均有顯著性(P0.01),Bc1-2蛋白表達明顯下降P0.01)；而與HF-C組相比,給予4-PBA干預后HF-PBA組CHOP、 caspase-12、p-JNK以及bax蛋白表達明顯下調差異均有顯著性(P0.01),Bc1-2蛋白表達明顯增加(P0.01)。結論：1長期高果糖飲食導致Wistar大鼠胰島p細胞出現(xiàn)內質網(wǎng)應激信號通路介導的凋亡以及胰島功能的損傷。3 4-PBA通過緩解內質網(wǎng)應激信號通路介導的胰島p細胞凋亡改善了高果糖飲食大鼠胰島功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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本文編號：2396844