發(fā)布時(shí)間：2018-11-10 10:31

【摘要】：研究背景重癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是一種自身免疫性疾病,特征是神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)的突觸傳遞障礙,引起波動性的肌無力。大約80%的MG由針對煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)的抗體介導(dǎo),這些抗體通過增加AChR的降解和轉(zhuǎn)換,減少纖維終板上功能性AChR的數(shù)量,阻斷乙酰膽堿與AChR的結(jié)合,誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的肌肉纖維的損傷。最新研究結(jié)果顯示,低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(Low density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)與肌肉特異性受體酪氨酸激酶(Muscle specific kinase,MuSK)、煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)一起組成了NMJ終板膜特有的功能單元LRP4-MuSK-nAChR,該功能單元在神經(jīng)肌肉興奮化學(xué)傳遞的過程中發(fā)揮了重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MG患者肌肉中分揀微管連接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)含量較非MG患者明顯增高,并已證明SNX17與AChR共定位于NMJ處。SNX17屬于細(xì)胞分揀微管連接蛋白家族的一員,主要通過FERM-like基元與低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor,LDLR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)、P選擇素和載脂蛋白2(theε2 isoform of ApoE,ApoER2)等多種膜蛋白胞內(nèi)域NPxY基元結(jié)合,促進(jìn)這些膜蛋白高效率循環(huán)再利用到細(xì)胞膜。生物信息學(xué)研究顯示,LRP4與LRP1同屬于低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)家族,具有類似的NPx Y基元,因此,SNX17與LRP4存在相互作用可能,可使LRP4逃避溶酶體降解,促進(jìn)LRP4在胞內(nèi)的循環(huán)利用。為驗(yàn)證上述推測,本研究通過分別表達(dá)LRP4胞內(nèi)區(qū)和SNX17,采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)明確兩者之間相互作用關(guān)系,分析SNX17在MG患者NMJ處的作用。方法1.從MG患者肌肉中提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以LRP4胞內(nèi)區(qū)基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出LRP4胞內(nèi)區(qū)基因。2.利用分子克隆技術(shù)等方法,構(gòu)建pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)原核表達(dá)質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切鑒定。3.將原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,收集并純化,進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定。4.以SNX17基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物,從pET30a-SNX17擴(kuò)增出SNX17基因。5.利用分子克隆技術(shù)等方法,構(gòu)建pEASY-Blunt M2-SNX17真核表達(dá)質(zhì)粒。6.將真核表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt M2-SNX17轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,提取總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot的鑒定。7.通過抗His單克隆抗體磁珠以及抗Myc單克隆抗體磁珠進(jìn)行雙向Co-IP,Western blot的鑒定。結(jié)果1.限制性內(nèi)切酶雙酶切和測序分析均表明原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-LRP4胞內(nèi)區(qū)及真核表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt M2-SNX17構(gòu)建成功。2.經(jīng)過SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定,構(gòu)建的pET30a(+)-LRP4胞內(nèi)區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)成功,成功誘導(dǎo)表達(dá)His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白,分子量約17.8Kd。3.經(jīng)過SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定,構(gòu)建的pEASY-Blunt M2-SNX17真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)Myc-SNX17蛋白,分子量約53Kd。4.抗His單克隆抗體磁珠可通過His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白將Myc-SNX17沉淀出來。5.抗Myc單克隆抗體磁珠可通過Myc-SNX17將His-LRP4胞內(nèi)區(qū)沉淀出來。結(jié)論1.LRP4胞內(nèi)區(qū)與SNX17直接發(fā)生相互作用。2.SNX17可能通過與LRP4結(jié)合,誘導(dǎo)LRP4肌細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)再利用,募集nAChR,修復(fù)受損的NMJ。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R746.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱明振;張婧;張迎娜;呂杰;趙雪;方華;崔新征;張清勇;高峰;;重癥肌無力患者肌細(xì)胞分揀微管連接蛋白17的表達(dá)及作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2015年11期

2 許賢豪;重癥肌無力研究新展望[J];中華神經(jīng)科雜志;1997年02期

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本文編號：2322212