【摘要】：研究背景重癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是一種自身免疫性疾病,特征是神經肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)的突觸傳遞障礙,引起波動性的肌無力。大約80%的MG由針對煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)的抗體介導,這些抗體通過增加AChR的降解和轉換,減少纖維終板上功能性AChR的數量,阻斷乙酰膽堿與AChR的結合,誘導補體介導的肌肉纖維的損傷。最新研究結果顯示,低密度脂蛋白受體相關蛋白4(Low density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)與肌肉特異性受體酪氨酸激酶(Muscle specific kinase,MuSK)、煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)一起組成了NMJ終板膜特有的功能單元LRP4-MuSK-nAChR,該功能單元在神經肌肉興奮化學傳遞的過程中發(fā)揮了重要作用。課題組前期研究發(fā)現MG患者肌肉中分揀微管連接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)含量較非MG患者明顯增高,并已證明SNX17與AChR共定位于NMJ處。SNX17屬于細胞分揀微管連接蛋白家族的一員,主要通過FERM-like基元與低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor,LDLR)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)、P選擇素和載脂蛋白2(theε2 isoform of ApoE,ApoER2)等多種膜蛋白胞內域NPxY基元結合,促進這些膜蛋白高效率循環(huán)再利用到細胞膜。生物信息學研究顯示,LRP4與LRP1同屬于低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)家族,具有類似的NPx Y基元,因此,SNX17與LRP4存在相互作用可能,可使LRP4逃避溶酶體降解,促進LRP4在胞內的循環(huán)利用。為驗證上述推測,本研究通過分別表達LRP4胞內區(qū)和SNX17,采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、蛋白質印跡實驗(Western blot)明確兩者之間相互作用關系,分析SNX17在MG患者NMJ處的作用。方法1.從MG患者肌肉中提取總RNA,用反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA,以LRP4胞內區(qū)基因為模板設計引物,擴增出LRP4胞內區(qū)基因。2.利用分子克隆技術等方法,構建pET30a-LRP4胞內區(qū)原核表達質粒,并進行雙酶切鑒定。3.將原核表達質粒pET30a-LRP4胞內區(qū)轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,用IPTG誘導表達蛋白,收集并純化,進行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定。4.以SNX17基因為模板設計引物,從pET30a-SNX17擴增出SNX17基因。5.利用分子克隆技術等方法,構建pEASY-Blunt M2-SNX17真核表達質粒。6.將真核表達質粒pEASY-Blunt M2-SNX17轉染HEK293細胞,提取總蛋白,進行SDS-PAGE電泳和Western blot的鑒定。7.通過抗His單克隆抗體磁珠以及抗Myc單克隆抗體磁珠進行雙向Co-IP,Western blot的鑒定。結果1.限制性內切酶雙酶切和測序分析均表明原核表達質粒pET30a(+)-LRP4胞內區(qū)及真核表達質粒pEASY-Blunt M2-SNX17構建成功。2.經過SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定,構建的pET30a(+)-LRP4胞內區(qū)的原核表達質粒轉化BL21(DE3)成功,成功誘導表達His-LRP4胞內區(qū)蛋白,分子量約17.8Kd。3.經過SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定,構建的pEASY-Blunt M2-SNX17真核表達質粒的轉染細胞后表達Myc-SNX17蛋白,分子量約53Kd。4.抗His單克隆抗體磁珠可通過His-LRP4胞內區(qū)蛋白將Myc-SNX17沉淀出來。5.抗Myc單克隆抗體磁珠可通過Myc-SNX17將His-LRP4胞內區(qū)沉淀出來。結論1.LRP4胞內區(qū)與SNX17直接發(fā)生相互作用。2.SNX17可能通過與LRP4結合,誘導LRP4肌細胞內的循環(huán)再利用,募集nAChR,修復受損的NMJ。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R746.1

【參考文獻】

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1 朱明振;張婧;張迎娜;呂杰;趙雪;方華;崔新征;張清勇;高峰;;重癥肌無力患者肌細胞分揀微管連接蛋白17的表達及作用[J];中華實驗外科雜志;2015年11期

2 許賢豪;重癥肌無力研究新展望[J];中華神經科雜志;1997年02期

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本文編號：2322213