【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是以骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病,可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加。在骨代謝中,過(guò)量ROS引起破骨細(xì)胞骨吸收增加,成骨細(xì)胞骨形成減少,骨代謝的平衡被破壞,造成骨量丟失、骨質(zhì)疏松的發(fā)生。中藥仙茅來(lái)源于石蒜科植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn,CG)的干燥根莖,能夠強(qiáng)筋骨、抗衰老、益精血,是著名的補(bǔ)腎中藥。仙茅苷為仙茅中主要活性成分,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗骨質(zhì)疏松、抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。課題組前期研究采用活性炭處理的血清和無(wú)酚紅培養(yǎng)基建立的成骨細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)仙茅苷無(wú)明顯的雌激素樣作用；通過(guò)復(fù)制小鼠鐵超載氧化應(yīng)激模型,發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高鐵超載小鼠的骨密度,調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)蛋白的表達(dá),表明仙茅苷能夠保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的骨組織,但作用機(jī)制尚不清楚。另一方面,仙茅苷屬于苯甲酸酯類酚苷,口服絕對(duì)生物利用度較低,仙茅苷的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有待闡明。因此,本課題研究了仙茅苷保護(hù)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制,并明確了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物：本課題采用過(guò)氧化氫(H2O2)建立氧化損傷成骨細(xì)胞模型,明確了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的保護(hù)作用；通過(guò)觀察仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞中FoxO1通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響,初步明確了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制；同時(shí),應(yīng)用LC-Q-TOF/MS的方法鑒定了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,解釋了仙茅苷較低生物利用度的代謝機(jī)制,并觀察了主要代謝產(chǎn)物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用,以探索仙茅昔的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1、仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞功能和抗氧化體系的影響采用H2O2氧化損傷成骨細(xì)胞模型,以細(xì)胞活力、堿性磷酸酶(ALP)酶活力、骨結(jié)節(jié)礦化量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)酶活力、ROS水平、細(xì)胞周期和線粒體膜電勢(shì)為指標(biāo),考察仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示,仙茅苷(10-8、10-7和10-6mol/L)能夠顯著提高氧化損傷成骨細(xì)胞的細(xì)胞細(xì)胞活力、提高ALP酶活力、促進(jìn)骨結(jié)節(jié)的礦化,提高SOD和CAT酶活力、降低ROS水平,提高線粒體膜電勢(shì)和減少細(xì)胞周期阻滯。2、仙茅苷保護(hù)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制研究本實(shí)驗(yàn)采用H2O2氧化損傷成骨細(xì)胞模型,從蛋白水平研究了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。Western結(jié)果表明,仙茅苷能夠上調(diào)總蛋白中sod和OPG的表達(dá)并下調(diào)Rankl的表達(dá)；通過(guò)分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白,發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高FoxO1a蛋白在細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)蛋白的比例,且SOD蛋白表達(dá)同時(shí)上調(diào)。熒光免疫組織化學(xué)定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,仙茅苷能夠顯著提高FoxO1a細(xì)胞核在蛋白量,繼而促進(jìn)細(xì)胞核中FoxO1a與ATF4因子的相互作用。3、仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究建立LC-Q-TOF/MS檢測(cè)仙茅苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法,確定了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的7個(gè)代謝產(chǎn)物,其中M1、M2和M3為Ⅰ相代謝產(chǎn)物,由仙茅苷糖昔鍵水解或者酯鍵水解而成;M4、M5、M6和M7為仙茅苷在大鼠體內(nèi)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物,由仙茅苷、M1和M2葡萄糖醛酸化以及去甲基化而成。Ⅰ代謝相產(chǎn)物分布于血漿、尿液和組織中,而Ⅱ相葡萄糖醛酸接合產(chǎn)物分布在血漿和膽汁中。4、仙茅苷和代謝產(chǎn)物M2藥物含量的分析通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)代謝物M2相對(duì)含量最高且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他代謝產(chǎn)物,經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn),代謝產(chǎn)物M2的血藥濃度遠(yuǎn)高于仙茅苷。另外,M2在重要的組織如腎、骨髓、胸腺、子宮、睪丸和大腦組織中均有分布且含量較高,推測(cè)代謝產(chǎn)物M2可能具有活性。5、代謝產(chǎn)物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用通過(guò)觀察仙茅苷主要代謝物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)M2可顯著促進(jìn)氧化損傷成骨細(xì)胞的增殖,表明代謝物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2308917