【摘要】：骨質疏松癥是以骨微細結構破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病,可導致骨脆性和骨折風險性增加。在骨代謝中,過量ROS引起破骨細胞骨吸收增加,成骨細胞骨形成減少,骨代謝的平衡被破壞,造成骨量丟失、骨質疏松的發(fā)生。中藥仙茅來源于石蒜科植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn,CG)的干燥根莖,能夠強筋骨、抗衰老、益精血,是著名的補腎中藥。仙茅苷為仙茅中主要活性成分,具有抗氧化、增強免疫、抗骨質疏松、抗抑郁和神經(jīng)保護等多種生物活性。課題組前期研究采用活性炭處理的血清和無酚紅培養(yǎng)基建立的成骨細胞模型,發(fā)現(xiàn)仙茅苷無明顯的雌激素樣作用；通過復制小鼠鐵超載氧化應激模型,發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高鐵超載小鼠的骨密度,調節(jié)骨代謝相關蛋白的表達,表明仙茅苷能夠保護氧化應激狀態(tài)下的骨組織,但作用機制尚不清楚。另一方面,仙茅苷屬于苯甲酸酯類酚苷,口服絕對生物利用度較低,仙茅苷的體內藥效物質基礎有待闡明。因此,本課題研究了仙茅苷保護氧化損傷成骨細胞的作用機制,并明確了仙茅苷在大鼠體內的代謝產(chǎn)物：本課題采用過氧化氫(H2O2)建立氧化損傷成骨細胞模型,明確了仙茅苷對氧化損傷成骨細胞的保護作用；通過觀察仙茅苷對氧化損傷成骨細胞中FoxO1通路關鍵蛋白表達的影響,初步明確了仙茅苷對氧化損傷成骨細胞保護作用的機制；同時,應用LC-Q-TOF/MS的方法鑒定了仙茅苷在大鼠體內的代謝產(chǎn)物,解釋了仙茅苷較低生物利用度的代謝機制,并觀察了主要代謝產(chǎn)物M2對氧化損傷成骨細胞的作用,以探索仙茅昔的藥效物質基礎。1、仙茅苷對氧化損傷成骨細胞功能和抗氧化體系的影響采用H2O2氧化損傷成骨細胞模型,以細胞活力、堿性磷酸酶(ALP)酶活力、骨結節(jié)礦化量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、過氧化氫酶(CAT)酶活力、ROS水平、細胞周期和線粒體膜電勢為指標,考察仙茅苷對氧化損傷成骨細胞的作用。結果顯示,仙茅苷(10-8、10-7和10-6mol/L)能夠顯著提高氧化損傷成骨細胞的細胞細胞活力、提高ALP酶活力、促進骨結節(jié)的礦化,提高SOD和CAT酶活力、降低ROS水平,提高線粒體膜電勢和減少細胞周期阻滯。2、仙茅苷保護氧化損傷成骨細胞的作用機制研究本實驗采用H2O2氧化損傷成骨細胞模型,從蛋白水平研究了仙茅苷對氧化損傷成骨細胞的保護機制。Western結果表明,仙茅苷能夠上調總蛋白中sod和OPG的表達并下調Rankl的表達；通過分別提取細胞核和細胞質蛋白,發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高FoxO1a蛋白在細胞核/細胞質蛋白的比例,且SOD蛋白表達同時上調。熒光免疫組織化學定位實驗結果表明,仙茅苷能夠顯著提高FoxO1a細胞核在蛋白量,繼而促進細胞核中FoxO1a與ATF4因子的相互作用。3、仙茅苷在大鼠體內的代謝產(chǎn)物研究建立LC-Q-TOF/MS檢測仙茅苷在大鼠體內代謝產(chǎn)物的方法,確定了仙茅苷在大鼠體內的7個代謝產(chǎn)物,其中M1、M2和M3為Ⅰ相代謝產(chǎn)物,由仙茅苷糖昔鍵水解或者酯鍵水解而成;M4、M5、M6和M7為仙茅苷在大鼠體內的Ⅱ相代謝產(chǎn)物,由仙茅苷、M1和M2葡萄糖醛酸化以及去甲基化而成。Ⅰ代謝相產(chǎn)物分布于血漿、尿液和組織中,而Ⅱ相葡萄糖醛酸接合產(chǎn)物分布在血漿和膽汁中。4、仙茅苷和代謝產(chǎn)物M2藥物含量的分析通過比較發(fā)現(xiàn)代謝物M2相對含量最高且遠遠高于其他代謝產(chǎn)物,經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn),代謝產(chǎn)物M2的血藥濃度遠高于仙茅苷。另外,M2在重要的組織如腎、骨髓、胸腺、子宮、睪丸和大腦組織中均有分布且含量較高,推測代謝產(chǎn)物M2可能具有活性。5、代謝產(chǎn)物M2對氧化損傷成骨細胞的作用通過觀察仙茅苷主要代謝物M2對氧化損傷成骨細胞的作用,發(fā)現(xiàn)M2可顯著促進氧化損傷成骨細胞的增殖,表明代謝物M2對氧化損傷成骨細胞具有保護作用。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R580

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本文編號：2308916