發(fā)布時間：2018-11-03 20:02

【摘要】：目的類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性關節(jié)滑膜炎癥及血管翳形成為主要病理特征的系統(tǒng)性自身免疫病。RA的發(fā)病機制尚不十分清楚,有研究報道鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin,CRT)可能參與了RA滑膜炎癥的形成。本課題在前期研究基礎上,采用ELISA及免疫熒光的方法檢測了CRT及黏附分子在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表達,并分析血清、滑液中CRT與黏附分子含量的相關性;然后利用臍靜脈內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型分析了CRT對黏附分子表達的調(diào)節(jié)作用及其分子機制。通過研究CRT調(diào)節(jié)細胞黏附作用進而參與滑膜炎癥形成,從新的角度探討RA的病理機制,為RA的臨床診斷和治療奠定實驗基礎。方法1.本研究所選取的患者標本均來自2013年2月至2014年2月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院風濕免疫科和天津醫(yī)院關節(jié)外科中心,其中血清標本包括RA患者60例,女47例,男13例,年齡55~79歲。關節(jié)滑膜和滑液標本:RA:10例,其中女7例,男3例,年齡52~62歲;OA:14例,其中女10例,男4例,年齡56~69歲。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測RA血清和滑液中CRT及黏附分子的含量。2.采用免疫組織熒光方法分析CRT和黏附分子在RA及OA滑膜中的定位。3.分離培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細胞,分析CRT對ICAM-1表達的影響。4.免疫印跡(Western blot)檢測CRT對Akt及eNOS活化的影響,并分析PI3K及e NOS抑制劑作用后ICAM-1的表達。統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件。計量資料以sx±表示,兩組間比較采用Student-Newman-Kenls檢驗進行統(tǒng)計分析。檢驗水準為雙側(cè)a=0.05。結(jié)果1.可溶性CRT在RA患者血清及滑液中表達量為(5.359±2.27)ng/ml,(4.997±0.826)ng/ml;可溶性ICAM-1以及VCAM-1在血清中的含量分別為(485.772±197.612)ng/ml,(419.609±188.338)ng/ml;在關節(jié)液中為(579.467±70.604)ng/ml和(511.368±101.39)ng/ml。分別分析RA患者血清和滑液中CRT與 s ICAM-1以及CRT與s VCAM-1含量的相關性。結(jié)果顯示,血清中CRT與s ICAM-1及與s VCAM-1均呈正相關(R2分別為0.612,0.554)差異具有統(tǒng)計學意義。關節(jié)液中CRT與s ICAM-1及與s VCAM-1也呈正相關(R2分別為0.710,0.405),差異具有統(tǒng)計學意義。2.免疫組織熒光結(jié)果顯示,與OA組相比,CRT及黏附分子ICAM-1,VCAM-1在RA滑膜組織的表達均增高;其中CRT在RA的滑膜襯里層和襯里下層,血管內(nèi)皮細胞及血管周圍均有較強的表達,而在OA的襯里層和血管周圍有較弱的表達。結(jié)果顯示,CRT在兩組患者滑膜組織中的表達量和定位均存在顯著的差異。ICAM-1與CRT共同表達在RA滑膜組織的血管內(nèi)皮細胞上,VCAM-1則主要定位在RA滑膜襯里層細胞。3.CRT作用于內(nèi)皮細胞使黏附分子的表達上調(diào),且具有劑量依賴性。當CRT濃度為5ng/ml時,與空白對照組無統(tǒng)計學差異(平均熒光強度MFI:(98.7±10.51)),當濃度達到50n/ml及更高時ICAM-1的表達顯著升高。4.CRT能夠促使內(nèi)皮細胞Akt的磷酸化,激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt被抑制時,CRT活化的e NOS減少。PI3K/Akt-e NOS通路被抑制劑后CRT誘導的ICAM-1的表達也明顯下調(diào)。結(jié)論1.CRT及可溶性黏附分子s ICAM-1、s VCAM-1在RA患者血清及滑液中的表達量均升高,且CRT與這兩種黏附分子在血清和關節(jié)液中的含量均呈正相關。2.CRT與ICAM-1共同表達在RA滑膜血管內(nèi)皮細胞及血管周圍;與VCAM-1則共定位于RA滑膜襯里層細胞。3.CRT能夠上調(diào)內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達,且具有劑量依賴性。4.CRT可通過活化內(nèi)皮細胞中的Akt蛋白,從而調(diào)節(jié)ICAM-1的表達。另外eNOS作為PI3K/Akt的下游分子也參與了CRT對黏附分子的調(diào)節(jié)。本課題研究結(jié)果提示CRT可通過PI3K/Akt/e NOS這條信號通路調(diào)節(jié)黏附分子的表達進而促進RA滑膜炎癥反應,參與RA病理機制的形成。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22;R446.6

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1 陳雅;呂婷;胡晶晶;吳燕潔;仇雅t，

本文編號：2308864