【摘要】：目的:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)造成的嚴(yán)重和危害性較大的一種慢性并發(fā)癥。其發(fā)病機制與慢性炎癥有關(guān),動物實驗和DN臨床患者的研究中均發(fā)現(xiàn)腎臟組織大量浸潤的炎癥細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主。其浸潤程度與腎組織的損害程度趨勢一致呈正相關(guān)。因此,巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是加快DN發(fā)展的重要原因之一。TLR4是巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體,TLR4信號通路在DN的發(fā)病中的作用逐漸受到人們的關(guān)注,許多臨床和實驗均表明TLR4在高糖狀態(tài)下表達(dá)增高。生理條件下LPS結(jié)合巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的TLR4可誘導(dǎo)促炎信號和抗炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),分別產(chǎn)生促炎因子TNF-α、IL-β和抗炎因子IL-10,來維持炎癥因子的平衡。那么,在糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的TLR4的激活是否改變了這種平衡狀態(tài),導(dǎo)致DN的發(fā)生呢?目前還未見詳細(xì)報道。因此,本課題依據(jù)前期結(jié)果和文獻資料,在體外用高糖培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,用TLR4的不同配體進行刺激,觀察TLR4介導(dǎo)的促炎和抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá),探討高糖對巨噬細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,明確巨噬細(xì)胞在DM和DN發(fā)生中的炎癥機制。方法:1經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、2、4、8、16、24小時收集細(xì)胞。用Real-time PCR檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-αm RNA的表達(dá)水平。2經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、2、4、8、16、24小時收集細(xì)胞上清;用HSP60刺激24h收集細(xì)胞上清用ELISA檢測炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平。3經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,再用LPS刺激,在0、15、30、60、120、180min收集細(xì)胞。另一組用LPS和HSP60刺激,在0、30、60、180min收集細(xì)胞,用Western blot檢測p110δ、P-NF-κB p65、NF-κB p65、P-AKT、AKT的表達(dá)水平。結(jié)果:1與空白對照組相比,IL-10m RNA正常組與高糖組在2h、4h時表達(dá)明顯增高,IL-1βm RNA正常組與高糖組在2h、4h、8h時表達(dá)明顯增高,TNF-αm RNA的正常組與高糖組在2h、4h、16h、24h時表達(dá)明顯增高。對照組IL-10m RNA表達(dá)量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后的2小時,高糖組出現(xiàn)在4小時,出現(xiàn)延遲現(xiàn)象。高糖組在4小時IL-1βm RNA表達(dá)量明顯高于正常組。高糖組在2小時TNF-αm RNA表達(dá)量顯著高于正常組。2上清ELISA結(jié)果,IL-10無明顯變化,LPS刺激時,IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生隨著時間延長均逐漸升高,且高糖組在任一時間點均高于正常組。LPS和HSP60同時刺激24h時,LPS刺激下IL-1β、TNF-α變化顯著,且高糖組高于正常組,HSP60刺激下變化不明顯。3 Western blot結(jié)果顯示:LPS刺激細(xì)胞0、15、30、60、120、180min,P-NF-κB p6515分鐘時表達(dá)量增加,正常組60分鐘,高糖組15分鐘時時達(dá)到高峰,P-AKT60分鐘時表達(dá)增高,高糖組在同一時間點總體高于正常組;LPS和HSP60刺激細(xì)胞0、30、60、180min,高糖狀態(tài)下p110δ無論在LPS還是HSP60刺激下表達(dá)水平降低,P-NF-κB p65、P-AKT在LPS的作用下變化明顯。結(jié)論:1在不同配體刺激下,促炎因子IL-1β、TNF-α無論在上清ELISA水平還是P-NF-κB p65,P-AKT的蛋白水平,總體上LPS較HSP60作用顯著。2 p110δ在高糖狀態(tài)下無論LPS還是HSP60刺激表達(dá)水平均降低。3 TLR4介導(dǎo)的促炎信號通路高糖狀態(tài)下明顯高于正常組�？寡仔盘柗肿幼兓幻黠@。
[Abstract]:Objective: Diabetic nephropathy (DN) is a serious and harmful chronic complication caused by diabetes mellitus (DM). The pathogenesis of DN is related to chronic inflammation. Macrophages are found to be the main infiltrating inflammatory cells in renal tissues in animal experiments and clinical studies of DN patients. TLR4 is a pattern recognition receptor on the surface of macrophages. The role of TLR4 signaling pathway in the pathogenesis of DN has attracted more and more attention. Many clinical and experimental studies have shown that TLR4 is hyperglycemic. Under physiological conditions, LPS binds to TLR4 on the surface of macrophages and dendritic cells to induce the transduction of pro-inflammatory and anti-inflammatory signals, producing pro-inflammatory factors TNF-alpha, IL-beta and anti-inflammatory factors IL-10 to maintain the balance of inflammatory factors, respectively. So, according to the previous results and literature, macrophages were cultured with high glucose and stimulated with different ligands of TLR4 in vitro to observe the expression of TLR4-mediated pro-inflammatory and anti-inflammatory signal transduction molecules, and to explore the effect of high glucose on TLR4 signal transduction in macrophages. Methods: 1 THP-1 cells activated by PMA were cultured in normal medium and high glucose medium for 24 hours, then stimulated by LPS and collected at 0, 2, 4, 8, 16 and 24 hours. The expression levels of inflammatory factors IL-10, IL-1beta and TNF-alpha m RNA were detected by Real-time PCR. Cell supernatant was collected at 0,2,4,8,16 and 24 hours after the cells were cultured in normal medium and high glucose medium for 24 hours. The supernatant was collected at 24 hours after the cells were stimulated by HSP60 and the expression levels of inflammatory factors IL-10, IL-1beta and TNF-alpha were detected by ELISA. 3 PMA-activated THP-1 cells were cultured in normal medium and high glucose medium for 24 hours. One group was stimulated by LPS for 0,15,30,60,120,180 minutes, and the other group was stimulated by LPS and HSP60 for 0,30,60,180 minutes. The expression of p110delta, P-NF-kappa B p65, NF-kappa B p65, P-AKT and AKT was detected by Western blot. Results: 1 Compared with the blank control group, the expression of IL-10m RNA in normal group and high glucose group was significantly increased at 2 h and 4 h. The expression of IL-10m RNA in normal group and high glucose group increased significantly at 2h, 4H and 8h, while that in normal group and high glucose group increased significantly at 2h, 4h, 16h and 24h. The peak expression of IL-10m RNA in control group was 2 hours after LPS stimulation, and that in high glucose group was 4 hours after LPS stimulation. The expression of TNF-alpha m RNA in the high glucose group was significantly higher than that in the normal group at 2 hours. The results of ELISA in the supernatant of 2 hours showed that IL-10 had no significant change. The production of IL-1beta and TNF-alpha increased gradually with the prolongation of LPS stimulation, and the expression of IL-1beta and TNF-alpha in the high glucose group was higher than that in the normal group at any time point. Western blot showed that the expression of P-NF-kappa B p65 15 minutes increased in LPS-stimulated cells at 0,15,30,60,120,180 minutes. The expression of P-NF-kappa B p65 15 minutes increased in normal group at 60 minutes. The expression of P-AKT reached its peak at 15 minutes in high glucose group and increased at 60 minutes in high glucose group. The expression levels of p110delta were decreased under the stimulation of LPS and HSP60, and the expression levels of P-NF-kappa B p65 and P-AKT were significantly changed under the stimulation of LPS and HSP60 at 0,30,60,180 min. CONCLUSION: 1 Under the stimulation of different ligands, the levels of pro-inflammatory factors IL-1beta and TNF-alpha in the supernatant, ELISA, P-NF-kappa B p65 and P-AKT were higher than those of HSP on the whole. The expression level of LPS and HSP60 was decreased under high glucose condition. 3 TLR4-mediated pro-inflammatory signaling pathway in high glucose condition was significantly higher than that in normal control group.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2

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本文編號：2224995