【摘要】：背景和目的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)主要表現(xiàn)為骨骼肌、脂肪、肝臟等靶組織器官的胰島素敏感性下降。骨骼肌是人體最大的胰島素利用組織,對全身葡萄糖代謝起到了至關重要的作用。因此,從骨骼肌組織入手,通過篩查遺傳性T2DM實驗動物骨骼肌組織的異常表達基因或者突變基因,研究其對T2DM的作用,就成為探索T2DM發(fā)生機制和治療靶點的一個有效途徑。前期,我們在長爪沙鼠近交系培育過程中,偶然發(fā)現(xiàn)一個分支的長爪沙鼠空腹血糖較高,糖耐量受損,且這一性狀具有遺傳性。抑制消減雜交發(fā)現(xiàn)真核蛋白延長因子1α2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,eEF1A2)在T2DM長爪沙鼠骨骼肌中表達顯著降低。eEF1A2在真核細胞蛋白翻譯階段,以GTP依賴的方式促進翻譯延長和密碼子識別準確性。近期研究發(fā)現(xiàn),胰島素可調節(jié)eEF1A2表達和轉位。eEF1A可促進酵母葡萄糖攝取,糖原合成和脂類轉運。此外,eEF1A2通過活化PI3K/Akt通路參與多種細胞事件。這提示,在骨骼肌中eEF1A2可能能通過PI3K/Akt/GLUT4通路調節(jié)葡萄糖攝取和胰島素敏感性,eEF1A2的異常表達與T2DM病理進程相關。為驗證這一假說,本研究將在動物水平和細胞水平上研究eEF1A2對骨骼肌糖代謝的作用和分子機制。實驗方法我們首先通過同源擴增和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆長爪沙鼠eEF1A2 cDNA序列全長,并進行同源性分析。隨后,利用三種T2DM動物模型,分析骨骼肌中eEF1A2表達及其甲基化變化。在正常肌管和兩種胰島素抵抗細胞模型中,探討eEF1A2對胰島素刺激后肌管的葡萄糖攝取,胰島素信號活化和脂質生成利用相關基因表達的調節(jié)作用。最后,通過腺相關病毒注射實現(xiàn)db/db小鼠骨骼肌eEF1A2過表達,檢測其在動物水平上對葡萄糖耐受和代謝相關基因的調節(jié)作用。實驗結果1.利用RACE技術克隆長爪沙鼠eEF1A2基因cDNA全長1812 bp,CDs長1392 bp,編碼463個氨基酸。同源性分析顯示,長爪沙鼠eEF1A2核苷酸序列與人類、大鼠和小鼠的同源性分別為88.6%,94.0%和93.8%;其氨基酸序列與人類、大鼠和小鼠的同源性分別為100%,99.9%和99.9%。這提示長爪沙鼠可能是研究人類eEF1A2蛋白功能的良好實驗動物。2.在自發(fā)性T2DM長爪沙鼠、db/db小鼠和高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導的T2DM小鼠中,其骨骼肌eEF1A2表達均顯著降低,且這一變化不依賴于eEF1A2啟動子區(qū)域甲基化水平的改變。3.胰島素可在60 min內顯著上調正常飲食小鼠和高脂誘導T2DM小鼠骨骼肌eEF1A2表達,但高脂小鼠eEF1A2表達增加量低于正常飲食小鼠。這表明胰島素可上調骨骼肌eEF1A2表達,且在T2DM下這一作用減弱。4.在分化的C2C12肌管細胞中,eEF1A2過表達顯著增加胰島素刺激的葡萄糖攝取,GLUT4膜轉位,PI3K,Akt,ERK,m TOR,GSK-3β胰島素信號分子的活化,以及脂質生成相關基因乙酰輔酶A羧化酶α(Acetyl CoA carboxylaseα,Acc-1),脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,Fas),甘油三酯水解基因:脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,Lpl),β-氧化基因:肉堿棕櫚酰轉移酶1(Carnitine palmitoyl transterase-1,Cpt-1)的表達。這一結果提示,在正常骨骼肌細胞中,eEF1A2促進胰島素敏感性。5.分別利用高濃度胰島素和棕櫚酸構建胰島素抵抗細胞模型。在高濃度胰島素誘導的胰島素抵抗模型中,eEF1A2過表達顯著增加肌管中胰島素刺激的葡萄糖攝取,GLUT4膜轉位,PI3K,ERK,GSK-3β活化,且這一作用可被Akt抑制劑MK-2206 2HCl和PI3K抑制劑LY294002逆轉。這表明在高濃度胰島素誘導的胰島素抵抗細胞模型中,eEF1A2能通過激活PI3K/Akt通路增強胰島素敏感性。然而在棕櫚酸誘導胰島素抵抗模型中,eEF1A2過表達顯著降低了葡萄糖攝取,GLUT4膜轉位,以及Akt,ERK,mTOR的活化。這表明在棕櫚酸誘導的胰島素抵抗模型中,eEF1A2加劇了肌管的胰島素抵抗。6.將eEF1A2過表達的腺相關病毒注射到db/db小鼠后肢骨骼肌中,實現(xiàn)eEF1A2骨骼肌過表達。注射兩周后,與對照相比,eEF1A2過表達小鼠表現(xiàn)為更強的葡萄糖和胰島素不耐受,且內質網應激基因CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,Chop)和免疫球蛋白重鏈結合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip)表達顯著增加。因此,eEF1A2加劇T2DM動物胰島素抵抗。結論:T2DM下調骨骼肌eEF1A2表達,且不依賴于其啟動子區(qū)域甲基化水平。eEF1A2表達受胰島素調節(jié),在正常肌管細胞中促進胰島素刺激的葡萄糖攝取和信號活化;但在棕櫚酸誘導的胰島素抵抗細胞和db/db小鼠模型中,加劇胰島素抵抗。這提示,eEF1A2有望成為治療T2DM的新靶點,為臨床治療T2DM提供新思路和理論基礎。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by decreased insulin sensitivity in skeletal muscle, fat, liver and other target tissues and organs.Skeletal muscle is the largest insulin-utilizing tissue in the human body and plays an important role in glucose metabolism.Therefore, starting from skeletal muscle tissue, genetic screening is carried out. Abnormal expression genes or mutant genes in skeletal muscle tissue of experimental animals with sexual T2DM and their effects on T2DM are an effective way to explore the pathogenesis and therapeutic targets of T2DM. Inhibitory subtractive hybridization revealed that eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2 (eEF1A2) was significantly reduced in the skeletal muscle of T2DM Mongolian gerbils. In addition, eEF1A2 participates in many cellular events by activating the PI3K/Akt pathway. This suggests that eEF1A2 may regulate glucose uptake and insulin sensitivity through the PI3K/Akt/GLUT4 pathway in skeletal muscle. To verify this hypothesis, we will study the effect and molecular mechanism of eEF1A2 on glucose metabolism in skeletal muscle at animal and cell levels. Methods We first cloned eEF1A2 from Mongolian gerbils by homologous amplification and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The expression of eEF1A2 and its methylation in skeletal muscle were analyzed by using three T2DM animal models. The glucose uptake, insulin signal activation and lipid production were studied in normal myotubes and two insulin resistant cell models. Finally, the over-expression of eEF1A2 in skeletal muscle of db/db mice was achieved by injection of adeno-associated virus, and the regulatory effect of eEF1A2 on glucose tolerance and metabolism-related genes was detected at animal level. Experimental results 1. The full-length cDNA of eEF1A2 gene of gerbil was cloned by RACE, and the CDs were 1392 BP long, encoding 463 amino acids. Homology analysis showed that the eEF1A2 nucleotide sequence of Mongolian gerbils was 88.6%, 94.0% and 93.8% homologous to human, and the amino acid sequence of Mongolian gerbils was 100%, 99.9% and 99.9% homologous to human, rat and mouse, respectively. The expression of eEF1A2 in skeletal muscle of male T2DM Mongolian gerbils, db/db mice and high fat diet (HFD) induced T2DM mice was significantly decreased, and this change was not dependent on the change of methylation level of eEF1A2 promoter region. 3. Insulin could significantly up-regulate the expression of eEF1A2 in skeletal muscle of normal diet mice and high fat-induced T2DM mice within 60 minutes. The expression of eEF1A2 in hyperlipidemia mice was lower than that in normal diet mice. This suggests that insulin can up-regulate the expression of eEF1A2 in skeletal muscle, and this effect is weakened under T2DM. 4. Overexpression of eEF1A2 in differentiated C2C12 myotube cells significantly increases insulin-stimulated glucose uptake, GLUT4 membrane translocation, PI3K, Akt, ERK, m TOR, GSK-3 beta insulin signaling. Activation of molecule No. 1, and activation of genes associated with lipid production, Acetyl CoA carboxylase alpha (Acc-1), Fatty acid synthase (Fas), triglyceride hydrolysis genes: Lipoprotein lipase (Lpl), beta-oxidation gene: Carnitine palmitoyl transterase-1 (Cpt-1) These results suggest that eEF1A2 promotes insulin sensitivity in normal skeletal muscle cells. 5. Insulin resistance cell models were constructed by high-concentration insulin and palmitic acid, respectively. PI3K, ERK, and GSK-3beta were activated, and this effect was reversed by Akt inhibitor MK-22062HCl and PI3K inhibitor LY294002. This suggests that eEF1A2 enhances insulin sensitivity by activating the PI3K/Akt pathway in insulin resistance cell model induced by high concentration of insulin. However, in palmitic acid-induced insulin resistance model, eEF1A2 is expressed by activating the PI3K/Akt pathway. This suggests that eEF1A2 exacerbates the insulin resistance in the myotube in a palmitic acid-induced insulin resistance model. 6. The overexpressed adeno-associated virus eEF1A2 was injected into the skeletal muscles of the hind limbs of db/db mice to achieve the overexpression of eEF1A2 in the skeletal muscles. Compared with the control group, the eEF1A2 overexpression mice showed stronger glucose and insulin intolerance, and the expression of CCAAT / enhancer binding protein homologous protein (Chop) and immunoglobulin heavy chain binding protein (Bip) increased significantly. Conclusion: T2DM down-regulates the expression of eEF1A2 in skeletal muscle and does not depend on its promoter methylation level. The expression of eEF1A2 is regulated by insulin and promotes insulin-stimulated glucose uptake and signal activation in normal myotube cells, but in palmitic acid-induced insulin resistance cells and db/d cells. This suggests that eEF1A2 may become a new target for the treatment of T2DM and provide new ideas and theoretical basis for the clinical treatment of T2DM.
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

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