本文選題：Nedd8 + PDX-1�。� 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：PDX-1(pancreatic duodenal homobox-1,胰腺-十二指腸同源盒基因-1)是調(diào)節(jié)胰島素合成和分泌功能最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,參與成熟胰島β細(xì)胞功能的維持。PDX-1的蛋白水平受到轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾等方式的調(diào)控,維持其在胰島β細(xì)胞中的高豐度。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,PDX-1通過泛素-蛋白酶體途徑快速降解,造成胰島β細(xì)胞損傷。已有的研究發(fā)現(xiàn),Cullin3-pcif1復(fù)合物是PDX-1的E3泛素連接酶,然而該復(fù)合物受何種信號(hào)激活仍然不得而知。類泛素蛋白Nedd8(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 8,神經(jīng)發(fā)育下調(diào)因子8)通過對蛋白質(zhì)進(jìn)行Neddylation修飾來調(diào)控靶蛋白的功能,其作用底物主要是Cullin家族成員,包括Cullin3;Cullin蛋白被Neddylation修飾后激活其E3泛素連接酶的活性。本論文的研究目的是探討Nedd8是否是Cullin3-pcif1介導(dǎo)的PDX-1蛋白降解的關(guān)鍵因子。借助于大鼠胰島β細(xì)胞系INS1細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn),高脂或者炎癥因子處理都能使細(xì)胞內(nèi)PDX-1的蛋白水平下調(diào),而Neddylation修飾水平顯著上升。外源性過表達(dá)Nedd8可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Neddylation修飾增強(qiáng),與此同時(shí),PDX-1蛋白水平下降;PDX-1蛋白水平與Neddylation修飾的程度呈相反的趨勢。過表達(dá)Nedd8并不會(huì)影響PDX-1的基因表達(dá)。給予放線菌酮(CHX)處理后發(fā)現(xiàn),Neddylation修飾的增強(qiáng)會(huì)降低PDX-1蛋白的穩(wěn)定性。MG132處理能夠逆轉(zhuǎn)PDX-1的蛋白水平,說明Nedd8介導(dǎo)的PDX-1蛋白的降解與泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)。反之,用MLN4924抑制Nedd8的活性可使細(xì)胞內(nèi)PDX-1蛋白的水平顯著升高。為了明確Nedd8與PDX-1之間的關(guān)系,我們使用了激光共聚焦顯微鏡和免疫共沉淀(CO-IP)技術(shù)。結(jié)果顯示,Nedd8與PDX-1之間存在共定位和相互作用。螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)顯示,過表達(dá)Nedd8能抑制胰島素基因啟動(dòng)子的活性,并且主要是減少了胰島素啟動(dòng)子A3/A4區(qū)域PDX-1的結(jié)合。定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,Neddylation修飾增強(qiáng)也能減少胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。鉀刺激的胰島素分泌功能實(shí)驗(yàn)(KSIS)顯示,Neddylation修飾增強(qiáng)下調(diào)了胰島β細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌以及胰島素的含量�？偠灾�,本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Nedd8能夠加速PDX-1蛋白的泛素化降解。在氧化應(yīng)激情況下,Nedd8的修飾活性增強(qiáng),通過對PDX-1的E3泛素連接酶復(fù)合物(Cullin3-pcif1)進(jìn)行修飾,加速了PDX-1蛋白的降解,從而抑制了胰島素基因的轉(zhuǎn)錄,降低了胰島素的含量和基礎(chǔ)胰島素的分泌。反之,抑制Nedd8的修飾活性可以增加細(xì)胞內(nèi)PDX-1蛋白的水平。本研究揭示生理及病理情況下Nedd8都參與了PDX-1蛋白水平的調(diào)控,為糖尿病的防治提供潛在的靶點(diǎn)。
[Abstract]:PDX-1 (pancreatic duodenal homobox-1 (pancreaticoduodenal homobox gene -1) is one of the most important transcription factors regulating insulin synthesis and secretion. The protein level of PDX-1 involved in the maintenance of the function of mature islet 尾 cells is regulated by transcription and posttranslational modification. Maintain its high abundance in islet 尾 cells. Under oxidative stress, PDX-1 was rapidly degraded by ubiquitin proteasome pathway, resulting in islet 尾 cell damage. It has been found that the Cullin3-pcif1 complex is the E3 ubiquitin ligase of PDX-1, but the signal activation of the complex remains unknown. Ubiquitin like protein Nedd8 (neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 8, neurodevelopmental downregulation factor 8) regulates the function of target proteins by modifying them with Neddylation, the main substrates of which are members of the Cullin family. The activity of E 3 ubiquitin ligase was activated by the modification of Cullin 3 by Neddylation. The purpose of this study was to investigate whether Nedd8 is a key factor in cullin3-pcif1 mediated degradation of PDX-1 protein. With the aid of rat islet 尾 cell line INS1, we found that both hyperlipidemia and inflammatory factor treatment could down-regulate the protein level of PDX-1, while the Neddylation level increased significantly. Exogenous overexpression of Nedd8 could induce the enhancement of Neddylation modification, while the level of PDX-1 protein decreased and the level of PDX-1 protein decreased. Overexpression of Nedd8 does not affect the expression of PDX-1 gene. After treatment with actinomycin (CHX), it was found that the enhancement of Neddylation could decrease the stability of PDX-1 protein. MG132 treatment could reverse the protein level of PDX-1, indicating that the degradation of PDX-1 protein mediated by Nedd8 was related to the ubiquitin proteasome pathway. On the contrary, inhibition of Nedd8 activity by MLN4924 significantly increased the level of PDX-1 protein. In order to clarify the relationship between Nedd8 and PDX-1, we used laser confocal microscopy and immunoprecipitation (CO-IP) technique. The results showed that there was colocalization and interaction between Nedd8 and PDX-1. Luciferase reporter gene technique showed that overexpression of Nedd8 inhibited the activity of insulin gene promoter and mainly reduced the binding of A3/A4 region of insulin promoter to PDX-1. Quantitative RT-PCR showed that the enhancement of Neddylation could also reduce the transcription of insulin gene. Potassium stimulated insulin secretion assay (KSIS) showed that Neddylation enhanced the basal insulin secretion and insulin content of islet 尾 cells. All in all, this study found that Nedd8 can accelerate the ubiquification degradation of PDX-1 protein. The modification activity of Nedd8 was enhanced under oxidative stress. By modifying the E3 ubiquitin ligase complex of PDX-1 (Cullin3-pcif1), the degradation of PDX-1 protein was accelerated and the transcription of insulin gene was inhibited. Decreased insulin content and basal insulin secretion. In contrast, inhibition of the modification activity of Nedd8 increased the level of PDX-1 protein in cells. This study revealed that both physiologically and pathologically Nedd8 is involved in the regulation of PDX-1 protein level and provides a potential target for the prevention and treatment of diabetes.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2117580