本文選題：成纖維細胞 + 細胞衰老�。� 參考：《天津醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討高糖水平在成纖維細胞衰老的過程中起到的作用,以及相關的作用機制。方法:(1)建立高糖模型觀察細胞形態(tài)變化,將NIH3T3細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),調整對照組葡萄糖濃度,使其保持在5.56mmol/L,而高糖組葡萄糖濃度則需達到33.33mmol/L;將WI-38細胞(人胚肺成纖維細胞)在加入1%NEAA(非必需氨基酸)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),調整對照組葡萄糖濃度為5.56mmol/L;高糖組葡萄糖濃度調整為33.33mmol/L。在37℃,5%二氧化碳濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察細胞形態(tài)并拍照,每隔72小時換液,細胞密度達到90%時傳代培養(yǎng)。(2)應用β-gal(半乳糖苷酶)細胞衰老染色法,檢測細胞衰老。取部分第10天、20天、30天、45天、60天的細胞進行消化,種植在6孔板上,第二天進行β-gal細胞衰老染色,取熱點部位進行計數(shù)與拍照,計算衰老細胞所占比例,并運用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗,設置統(tǒng)計標準為α0.05。(3)MTT細胞增殖實驗檢測細胞活性。將部分第10天、20天、30天、45天、60天的細胞進行消化,種植在96孔板上,加入DMSO試劑、MTT試劑等,用酶聯(lián)檢測儀OD490處測每孔吸光度,并運用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗,設置統(tǒng)計標準為α0.05。(4)運用q RT-PCR(定量反轉錄聚合酶鏈式反應)法,檢測p16的m RNA表達變化。取部分第10天、30天、60天的細胞,培養(yǎng)在6孔板上,第二天用Trizol RNA抽提試劑提取RNA,并進行q RT-PCR試驗,按照公式2-ΔCt=2-(目的基因Ct-管家基因Ct)來計算p16基因的相對表達量。運用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗,設置統(tǒng)計標準為α0.05(5)運用蛋白印跡(Western blot)法,檢測p16基因的蛋白表達變化。取部分第10天、30天、60天的細胞,培養(yǎng)在6孔板上,第二天用Western及IP裂解液裂解細胞并提取總蛋白,進行Western blot試驗,對得到的圖像進行灰度測定,運用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗,設置統(tǒng)計標準為α0.05。結果(1)細胞形態(tài)變化:高糖組與對照組隨著時間變化,細胞形態(tài)發(fā)生明顯差異性,高糖組的細胞體積較同時期的對照組細胞大,細胞內(nèi)色素沉著更豐富,細胞核更大,分葉更多。(2)β-半乳糖苷酶細胞衰老染色顯示,對照組與高糖組衰老細胞的比例隨時間的增長而差異越明顯,高糖組NIH3T3細胞衰老的比例在第45天、第60天明顯高于對照組細胞,差異具有統(tǒng)計學意義;而高糖組的WI-38細胞在第30天、第45天、第60天衰老細胞的比例也明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義,p0.05。(3)MTT細胞增殖實驗的結果表明,隨著時間的增長,NIH3T3與WI-38兩種細胞的高糖組細胞增殖速率明顯低于對照組,在第30天、第45天、第60天,差異均具有統(tǒng)計學意義,p0.05。(4)q RT-PCR的結果顯示,高糖組細胞的p16基因轉錄水平提高,且在第30天、第60天的差異具有統(tǒng)計學意義,p0.05。(5)Western blot實驗的結果顯示,高糖組細胞的p16蛋白表達水平上升,且在第30天、第60天的差異具有統(tǒng)計學意義,p0.05。結論:(1)高糖水平能夠使細胞衰老。實驗設計中兩組細胞只有糖濃度的不同,因此細胞的一系列變化均為高糖水平導致。(2)高糖水平導致p16基因表達上調。(3)p16基因表達上調可能是高糖水平導致成纖維細胞衰老的重要機制。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of high glucose level on the aging of fibroblasts and the mechanism of action . Methods : ( 1 ) To establish a high glucose model to observe the morphological changes of cells . The cells were cultured in DMEM medium supplemented with 1 % NEAA ( non - essential amino acid ) . ( 4 ) The expression of p16 gene was detected by using q - RT - PCR ( quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ) . The expression of p16 gene was detected by Western blot . ( 3 ) The results of MTT cell proliferation assay showed that , with the increase of time , the proliferation rate of the high - sugar group cells was significantly lower than that of the control group .
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

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2 王敏駿;陸樹良;盛昭園;青春;廖鎮(zhèn)江;;高糖環(huán)境中真皮成纖維細胞生物學行為的變化[J];中國糖尿病雜志;2006年02期

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本文編號：2013617