本文選題：成纖維細(xì)胞 + 細(xì)胞衰老�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討高糖水平在成纖維細(xì)胞衰老的過程中起到的作用,以及相關(guān)的作用機(jī)制。方法:(1)建立高糖模型觀察細(xì)胞形態(tài)變化,將NIH3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),調(diào)整對(duì)照組葡萄糖濃度,使其保持在5.56mmol/L,而高糖組葡萄糖濃度則需達(dá)到33.33mmol/L;將WI-38細(xì)胞(人胚肺成纖維細(xì)胞)在加入1%NEAA(非必需氨基酸)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),調(diào)整對(duì)照組葡萄糖濃度為5.56mmol/L;高糖組葡萄糖濃度調(diào)整為33.33mmol/L。在37℃,5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照,每隔72小時(shí)換液,細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)傳代培養(yǎng)。(2)應(yīng)用β-gal(半乳糖苷酶)細(xì)胞衰老染色法,檢測(cè)細(xì)胞衰老。取部分第10天、20天、30天、45天、60天的細(xì)胞進(jìn)行消化,種植在6孔板上,第二天進(jìn)行β-gal細(xì)胞衰老染色,取熱點(diǎn)部位進(jìn)行計(jì)數(shù)與拍照,計(jì)算衰老細(xì)胞所占比例,并運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),設(shè)置統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為α0.05。(3)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。將部分第10天、20天、30天、45天、60天的細(xì)胞進(jìn)行消化,種植在96孔板上,加入DMSO試劑、MTT試劑等,用酶聯(lián)檢測(cè)儀OD490處測(cè)每孔吸光度,并運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),設(shè)置統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為α0.05。(4)運(yùn)用q RT-PCR(定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法,檢測(cè)p16的m RNA表達(dá)變化。取部分第10天、30天、60天的細(xì)胞,培養(yǎng)在6孔板上,第二天用Trizol RNA抽提試劑提取RNA,并進(jìn)行q RT-PCR試驗(yàn),按照公式2-ΔCt=2-(目的基因Ct-管家基因Ct)來計(jì)算p16基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),設(shè)置統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為α0.05(5)運(yùn)用蛋白印跡(Western blot)法,檢測(cè)p16基因的蛋白表達(dá)變化。取部分第10天、30天、60天的細(xì)胞,培養(yǎng)在6孔板上,第二天用Western及IP裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白,進(jìn)行Western blot試驗(yàn),對(duì)得到的圖像進(jìn)行灰度測(cè)定,運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),設(shè)置統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為α0.05。結(jié)果(1)細(xì)胞形態(tài)變化:高糖組與對(duì)照組隨著時(shí)間變化,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯差異性,高糖組的細(xì)胞體積較同時(shí)期的對(duì)照組細(xì)胞大,細(xì)胞內(nèi)色素沉著更豐富,細(xì)胞核更大,分葉更多。(2)β-半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色顯示,對(duì)照組與高糖組衰老細(xì)胞的比例隨時(shí)間的增長(zhǎng)而差異越明顯,高糖組NIH3T3細(xì)胞衰老的比例在第45天、第60天明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而高糖組的WI-38細(xì)胞在第30天、第45天、第60天衰老細(xì)胞的比例也明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。(3)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),NIH3T3與WI-38兩種細(xì)胞的高糖組細(xì)胞增殖速率明顯低于對(duì)照組,在第30天、第45天、第60天,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。(4)q RT-PCR的結(jié)果顯示,高糖組細(xì)胞的p16基因轉(zhuǎn)錄水平提高,且在第30天、第60天的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。(5)Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,高糖組細(xì)胞的p16蛋白表達(dá)水平上升,且在第30天、第60天的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。結(jié)論:(1)高糖水平能夠使細(xì)胞衰老。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中兩組細(xì)胞只有糖濃度的不同,因此細(xì)胞的一系列變化均為高糖水平導(dǎo)致。(2)高糖水平導(dǎo)致p16基因表達(dá)上調(diào)。(3)p16基因表達(dá)上調(diào)可能是高糖水平導(dǎo)致成纖維細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of high glucose level on the aging of fibroblasts and the mechanism of action . Methods : ( 1 ) To establish a high glucose model to observe the morphological changes of cells . The cells were cultured in DMEM medium supplemented with 1 % NEAA ( non - essential amino acid ) . ( 4 ) The expression of p16 gene was detected by using q - RT - PCR ( quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ) . The expression of p16 gene was detected by Western blot . ( 3 ) The results of MTT cell proliferation assay showed that , with the increase of time , the proliferation rate of the high - sugar group cells was significantly lower than that of the control group .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 張愛紅;鄭全輝;鄭茗予;鄭愛華;;p21~(Waf1/Cip1)甲基化調(diào)控細(xì)胞衰老[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年08期

2 王敏駿;陸樹良;盛昭園;青春;廖鎮(zhèn)江;;高糖環(huán)境中真皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的變化[J];中國(guó)糖尿病雜志;2006年02期

3 牟姍,張慶怡,倪兆慧,童菊芳;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體在高糖誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其意義[J];中華腎臟病雜志;2002年03期

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本文編號(hào)：2013617