本文選題：PCSK6 + SiRNA��； 參考：《濟南大學》2015年碩士論文

【摘要】：目的1.探討si RNA沉默PCSK6基因?qū)δz原誘導性關節(jié)炎(CIA)成纖維樣滑膜細胞(FLS)生物學行為的影響。2.探討外源性PCSK6重組蛋白對類風濕關節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細胞生物學行為的影響及其分子機制。方法1.采用牛Ⅱ型膠原誘導大鼠CIA模型,取膝關節(jié)滑膜組織原代培養(yǎng)FLS;采用人工合成的大鼠P CSK6特異si RNA特異性抑制PCSK6在CIA FLS中的表達,以negative si RNA為陰性對照組,瞬時轉(zhuǎn)染24 h、36 h,采用RT-q PCR法檢測抑制效率,同時檢測PCSK6基因沉默后各相關基因的表達;采用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、ELISA等方法檢測干擾PCSK6表達后對大鼠CIA FLS增殖、侵襲、遷移、細胞周期和相關炎性因子分泌的影響。2.采用PCSK6重組蛋白誘導RA FLS,采用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、E LISA等方法檢測PCSK6重組蛋白對RA FLS增殖、侵襲、遷移、細胞周期和凋亡以及相關炎性因子分泌的影響;采用R T-q PCR法檢測PCSK6重組蛋白刺激后各相關基因的表達;采用W estern blot法檢測PCSK6重組蛋白對基質(zhì)金屬蛋白酶M MP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、m TOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信號轉(zhuǎn)導通路的影響。采用通路抑制劑P D98059、Stattic、PDTC分別抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路,與PCSK6重組蛋白共同作用于RA FLS,利用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、E LISA等方法檢測ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制劑對PCSK6重組蛋白誘導的R A FLS增殖、侵襲、遷移、細胞周期和凋亡以及相關炎性因子分泌的影響。結(jié)果1.轉(zhuǎn)染特異性si RNA-PCSK6后,干擾組與陰性對照組相比,PCSK6 m RNA水平明顯被抑制(P0.001),CIA FLS的增殖受到抑制(P0.001),細胞的侵襲和遷移能力下降(P0.001),腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P0.001),G0/G1期的細胞數(shù)目增多(P0.05),PCSK6下游基因CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表達均明顯下降(P0.05)。2.PCSK6重組蛋白誘導RA FLS后,與空白對照組相比,150ng/m L PCSK6重組蛋白促進效果最顯著,能使RA FLS的增殖速率顯著提高(P0.01),細胞的遷移和侵襲能力加強(P0.001),IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α分泌均升高(P0.05),S期和G2/M期的細胞數(shù)增多(P0.01),細胞晚期凋亡率減少(P0.01),PCSK6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表達均明顯升高(P0.001),MMP9前體和成熟的蛋白量均升高,誘導6h時可顯著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信號轉(zhuǎn)導通路。加入通路抑制劑P D98059、Stattic和PDTC后,150ng/m L PCSK6重組蛋白誘導的R A FLS的增殖(P0.05)、遷移(P0.001)、侵襲(P0.001)、炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α)分泌(P0.05)均受到抑制;通路抑制劑Stattic和PDTC可以逆轉(zhuǎn)PCSK6重組蛋白對細胞周期的誘導(P0.05);通路抑制劑PDTC可以逆轉(zhuǎn)PCSK6重組蛋白對F LS的細胞凋亡的影響(P0.05)。結(jié)論1.內(nèi)源性PCSK6基因沉默對CIA FLS的生物學行為具有一定抑制作用,為進一步研究C IA發(fā)病機制奠定基礎。2.外源性PCSK6重組蛋白對RA FLS的增殖、遷移、侵襲和炎癥因子分泌等生物學行為具有一定促進作用;P CSK6通過參與ERK、STAT3、NF-κB p65信號轉(zhuǎn)導通路來調(diào)控RA FLS的生物學行為。PCSK6可以作為研究RA發(fā)病機制、藥物篩選以及免疫治療的新靶點。
[Abstract]:Objective 1. to investigate the effect of Si RNA silencing of PCSK6 gene on the biological behavior of collagen induced arthritis (CIA) fibroid synovial cells (FLS).2. to explore the effect of exogenous PCSK6 recombinant protein on the biological behavior of rheumatoid arthritis (RA) fibroid synovial cells and its molecular mechanism. Method 1. using bovine type II collagen induced CIA model in rats The knee joint synovial tissue was cultured for FLS, and the P CSK6 specific Si RNA was used to inhibit the expression of PCSK6 in CIA FLS, and negative Si RNA was used as a negative control group. The inhibitory efficiency was detected by the transient transfection of 24 h, 36, and the expression of the related genes after the silence gene was detected. L, cell scratch, flow cytometry, ELISA and other methods were used to detect the proliferation, invasion, migration, cell cycle and related inflammatory factors of CIA FLS in rats after interference of PCSK6 expression..2. was used to induce RA FLS by PCSK6 recombinant protein, and MTT, Transwell, cell scratch, flow cytometry, E replication and other methods were used to detect the proliferation of the recombinant protein. Invasion, migration, cell cycle and apoptosis, and the effect of related inflammatory factors; the expression of the related genes were detected by the R T-q PCR method and the W estern blot method was used to detect the M MP9 and ERK of the matrix metalloproteinase. The pathway inhibitor P D98059, Stattic, and PDTC inhibit ERK, STAT3, NF- kappa B p65 pathway respectively, and the PCSK6 recombinant protein co acted on RA FLS. Results after 1. transfection of specific Si RNA-PCSK6, the level of PCSK6 m RNA was significantly inhibited (P0.001), the proliferation of CIA FLS was inhibited (P0.001), cell invasion and migration energy decreased (P0.001), tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha) and white blood cells, compared with the negative control group. The secretion of -1 beta (IL-1 beta) decreased (P0.001), and the number of cells in the G0/G1 phase increased (P0.05), and the downstream genes of the PCSK6 were CXCL9, MMP2, MMP9, NOSTRIN, HIF-1 alpha. The migration and invasion ability of cells increased (P0.001), IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-17, IL-6 and TNF- alpha increased (P0.05), and the number of cells in S and G2/M increased (P0.01). Significantly increased (P0.001), MMP9 precursor and mature protein content increased, and induced 6h to significantly activate ERK, STAT3, NF- kappa B p65 signal transduction pathway in FLS. Beta, IL-17, IL-6 and TNF- alpha) secretion (P0.05) were inhibited; pathway inhibitors Stattic and PDTC could reverse the cell cycle induction (P0.05) of the recombinant protein of PCSK6; the pathway inhibitor PDTC could reverse the effect of PCSK6 recombinant protein on the apoptosis of F LS. In order to further study the pathogenesis of C IA, the basis for the further study of the pathogenesis of C IA can promote the biological behavior of RA FLS, such as proliferation, migration, invasion and secretion of inflammatory factors, and P CSK6 can be used to regulate the biological behavior of ERK, STAT3, NF- kappa B. To study the pathogenesis of RA, drug screening and new targets of immunotherapy.
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

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本文編號：1978203