本文選題：高脂血癥 + 肝臟脂肪沉積�。� 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：脂代謝紊亂是心腦血管疾病和代謝綜合征的病理基礎(chǔ)。特別是脂質(zhì)在血液和肝臟中的過(guò)多積累會(huì)導(dǎo)致高脂血癥和非酒精性脂肪肝的形成,在全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類健康。我實(shí)驗(yàn)室在國(guó)家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2009ZX09103-623,2012ZX09102301-017)的資助下研制開(kāi)發(fā)了抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的新型重組融合蛋白SAK-HV。SAK-HV由SAK突變體、RGD序列和水蛭素C端12肽構(gòu)成,具有溶栓、抗凝和抑制血小板聚集的復(fù)合功能;在多種AS動(dòng)物模型中均發(fā)揮了良好的抗AS療效。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)SAK-HV可顯著地降低血膽固醇和甘油三酯水平,并明顯改善肝臟脂肪沉積。特別是在給藥14-21天觀察期內(nèi),SAK-HV降低膽固醇的效果顯著優(yōu)于上市藥物阿托伐他汀。本研究深入探索SAK-HV降脂機(jī)制,并在體外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中意外發(fā)現(xiàn)其對(duì)巨噬細(xì)胞具有促增殖作用。因此,本研究分為兩個(gè)部分:第一部分作為研究主體深入探索SAK-HV降脂機(jī)制,為治療高脂血癥和非酒精性脂肪肝提供新靶點(diǎn)和新思路;第二部分作為拓展研究初步闡明SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖機(jī)制,為進(jìn)一步了解SAK-HV的藥物機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。第一部分SAK-HV降脂機(jī)制研究本研究第一部分結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析以及一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入研究該蛋白降脂機(jī)制。量效分析表明,SAK-HV在高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠中降血脂量效關(guān)系呈現(xiàn)獨(dú)特的非劑量依賴的U型曲線。時(shí)效分析顯示其降脂效應(yīng)具有延時(shí)突發(fā)和迅猛的特性。SAK-HV有效減輕肝臟脂肪沉積,并降低肝、血炎癥,且未造成任何肝臟或出血病變產(chǎn)生。同時(shí),在觀察期14天內(nèi)SAK-HV降脂效果顯著優(yōu)于阿托伐他汀。在較阿托伐他汀具有相似的抗氧化應(yīng)激效果的同時(shí),SAK-HV可以更加有效地改善肝功能指標(biāo)。由于SAK-HV在肝和血中均可以有效降脂,且肝臟是參與脂代謝的關(guān)鍵器官,我們推測(cè)肝臟可能是SAK-HV發(fā)揮降脂效應(yīng)的主要靶器官之一。對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組芯片的基因差異表達(dá)分析提示SAK-HV誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)了肝細(xì)胞增殖,從而增加能量和物質(zhì)需求,最終造成包括PPAR信號(hào)通路激活在內(nèi)的脂代謝改變;并提示PGC-1α可能介導(dǎo)了肝臟類固醇激素合成過(guò)程,該過(guò)程與降低的血TC存在潛在的關(guān)聯(lián)。權(quán)重基因共表達(dá)分析WGCNA挖掘出肝臟中補(bǔ)體介導(dǎo)的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新通路可能構(gòu)成了 SAK-HV的一條關(guān)鍵降脂途徑。我們通過(guò)一系列體內(nèi)指標(biāo)檢測(cè)驗(yàn)證并拓展轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)SAK-HV在給藥7～14天之間觸發(fā)了經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活;同時(shí)激活了潛在降脂新通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α,有效改善肝臟脂肪沉積,并觸發(fā)了適度的肝增殖。另一方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示肝臟脂肪酸氧化代謝被增強(qiáng),并證實(shí)孕、雌激素合成代謝的增強(qiáng)導(dǎo)致它們?cè)诟闻K水平的顯著升高。此外,我們還檢測(cè)到SAK-HV增強(qiáng)了肝臟中LDLr介導(dǎo)的膽固醇吸收,且未對(duì)膽固醇分解、排泄途徑造成顯著影響。因此,我們初步提出假說(shuō):SAK-HV通過(guò)耗能的肝細(xì)胞增殖降低血脂,肝臟中補(bǔ)體介導(dǎo)的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α構(gòu)成了該蛋白一條新穎的降脂通路,其中PGC-1α可能介導(dǎo)了肝臟雌激素胞內(nèi)分泌,在降脂過(guò)程中發(fā)揮了潛在的作用。PGC-1α慢病毒敲低抑制了 SAK-HV對(duì)孕、雌激素合成途徑的增強(qiáng)作用,從而有效阻斷了 SAK-HV處理后肝臟中孕、雌激素水平的升高。該結(jié)果證實(shí)PGC-1α在肝增殖過(guò)程中介導(dǎo)了孕、雌激素的胞內(nèi)分泌。雌激素合成抑制劑來(lái)曲唑以及PGC-1α敲低均有效阻斷了 SAK-HV促肝增殖效應(yīng),顯著抑制了 SAK-HV降血脂及改善肝臟脂肪沉積的療效。來(lái)曲唑部分抑制了 SAK-HV增強(qiáng)的PPARα脂肪酸氧化,并阻斷了其通過(guò)LDLr介導(dǎo)的肝臟膽固醇吸收。PGC-1α敲低造成了SAK-HV給藥后肝TG水平較模型組的升高,這可能是由于肝臟增殖早期儲(chǔ)能過(guò)程中轉(zhuǎn)瞬的肝臟脂肪積累造成的;但是該現(xiàn)象在雌激素抑制實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn),表明PGC-1α在沒(méi)有雌激素作用的情況下仍然部分降低了肝TG水平。換而言之,雌激素對(duì)PGC-1α介導(dǎo)的降脂作用起到了放大的作用。類似地,PGC-1α敲低幾乎完全抑制了 PPARα脂肪酸氧化,而非來(lái)曲唑造成的部分抑制,進(jìn)一步證實(shí)了雌激素對(duì)PGC-1α誘導(dǎo)的PPARα脂肪酸氧化的放大作用。研究表明PGC-1α-雌激素代謝軸構(gòu)成了肝增殖過(guò)程中一個(gè)新穎的能量模型。染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)SAK-HV處理分別增強(qiáng)了 STAT3與C/EBPβ啟動(dòng)子,以及C/EBPβ與PGC-1α啟動(dòng)子的結(jié)合;STAT3磷酸化抑制劑STATTIC顯著抑制了 SAK-HV潛在降脂新通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α,并有效阻斷了 SAK-HV降血脂和改善肝臟脂肪沉積的療效。本研究證實(shí)肝臟中STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路構(gòu)成了一條新穎的降脂途徑。已有研究證實(shí)補(bǔ)體激活的IL-6-STAT3通路在肝增殖過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,其激活水平與肝增殖速率呈正比。我們利用補(bǔ)體抑制劑FUT-175和C3敲除分別有效減弱了 SAK-HV處理后ApoE-/-小鼠及C3-/-小鼠血C5α和IL-6的上調(diào)作用,顯著抑制下游STAT3-C/EBPβ-PGC-1α降脂通路,并阻斷了 SAK-HV觸發(fā)的肝臟增殖效應(yīng)。補(bǔ)體抑制還破壞了 SAK-HV在ApoE-/-小鼠中的降血脂及改善肝臟脂肪沉著的療效。通過(guò)SAK-HV在體外刺激小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL-C12,表明脫離了補(bǔ)體激活,SAK-HV處理無(wú)法導(dǎo)致BNL-C12細(xì)胞周期的改變,且無(wú)法激活STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路。這些體內(nèi)外結(jié)果充分證實(shí)補(bǔ)體在SAK-HV降脂效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。已有研究表明PPARα可以介導(dǎo)C3轉(zhuǎn)錄升高。但PGC-1α敲低造成的PPARα抑制在ApoE-/-小鼠中并未顯著影響SAK-HV觸發(fā)的補(bǔ)體激活水平,進(jìn)一步證明補(bǔ)體激活是SAK-HV觸發(fā)降脂效應(yīng)的原因,而非結(jié)果。綜上所述,第一部分研究證實(shí)PGC-1α在肝增殖過(guò)程中參與肝臟孕、雌激素合成;并提出補(bǔ)體在肝臟經(jīng)由STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新降脂通路誘導(dǎo)的PGC-1α-雌激素代謝軸構(gòu)成了新穎的肝臟增殖能量模型。該模型中,PGC-1α作為“點(diǎn)火器”點(diǎn)火并供能肝細(xì)胞激活;PGC-1α誘導(dǎo)的雌激素作為“點(diǎn)火放大器”放大PGC-1α的能量供應(yīng),并作為“啟動(dòng)裝置”觸發(fā)肝細(xì)胞從激活到增殖的狀態(tài)躍遷;該過(guò)程通過(guò)PPARα脂肪酸氧化消耗血、肝TG供能,并通過(guò)LDLr介導(dǎo)的肝臟膽固醇吸收降低血TC。SAK-HV基于該肝增殖能量模型的獨(dú)特降脂新策略有潛力成為治療非酒精性脂肪肝、高膽固醇血癥以及高甘油三酯血癥的新型短周期生物療法。同時(shí),該能量模型的提出也為肝增殖過(guò)程的脂代謝研究提供了新的啟示。第二部分SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖機(jī)制研究第一部分研究表明SAK-HV在體內(nèi)具有促肝細(xì)胞增殖效應(yīng)。巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖是AS致病的關(guān)鍵因素。因此,我們?cè)诘谝徊糠煮w外研究SAK-HV促肝細(xì)胞增殖機(jī)制的過(guò)程中,同時(shí)觀察了該抗AS蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有促增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示SAK-HV對(duì)小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL-CL2和小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MAEC增殖無(wú)顯著影響,卻意外地有效增強(qiáng)了小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、人類單核細(xì)胞THP-1以及小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的增殖效應(yīng)。研究表明SAK-HV具有促巨噬細(xì)胞增殖特性。因此本研究在闡明SAK-HV降脂機(jī)制之后又進(jìn)行了額外拓展,進(jìn)一步通過(guò)RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞探索SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖機(jī)制。我們首先篩查SAK-HV促增殖通路。結(jié)果表明SAK-HV處理RAW264.7細(xì)胞激活了增殖相關(guān)通路PI3K以及MAPKP38,JNK和ERK。通過(guò)抑制上述激活通路篩選出JNK和ERK MAPK是SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)的關(guān)鍵通路,并證實(shí)了它們?cè)赟AK-HV處理后原代巨噬細(xì)胞中的活化。我們繼而研究SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過(guò)SAK-HV的三個(gè)功能域分別刺激RAW264.7細(xì)胞,結(jié)果表明SAK突變體是SAK-HV唯一有效地促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖的功能域,且促增殖水平與SAK-HV相當(dāng);而野生型SAK則無(wú)此功能。結(jié)果證實(shí)SAK-HV通過(guò)SAK突變體功能域促發(fā)巨噬細(xì)胞增殖。激光共聚焦顯微鏡以及對(duì)RAW264.7細(xì)胞組分的Western b1ot檢測(cè)分析顯示SAK-HV可以進(jìn)入RAW264.7胞漿,并少量入核。結(jié)合質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),我們篩選出Uba1是與SAK-HV具有直接相互作用的蛋白。同時(shí)激光共聚焦顯微鏡證實(shí)二者在RAW264.7胞內(nèi)和核內(nèi)存在共定位�；趯�(duì)本研究數(shù)據(jù)的分析以及對(duì)大量已有研究的歸納,我們提出了一個(gè)SAK-HV介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖模型假說(shuō):SAK-HV通過(guò)阻斷Uba1與特定E2-E3酶對(duì)的交互作用抑制了它們對(duì)特定靶標(biāo)通路的泛素化修飾,促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)。通過(guò)在RAW264.7細(xì)胞和原代巨噬細(xì)胞中的Uba1抑制,我們證實(shí)了 Uba1在SAK-HV觸發(fā)的巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。該結(jié)果有力地支持了我們提出的模型假說(shuō)。在該模型的指引下,我們篩查發(fā)現(xiàn)伴隨總泛素化水平的升高,SAK-HV處理顯著抑制了 MEKK1泛素化水平。有研究表明,MEKK1自泛素化可以抑制其激酶活性,從而降低JNK和ERK MAPK通路磷酸化水平。結(jié)果表明SAK-HV通過(guò)抑制MEKK1泛素化水平激活下游JNK和ERK MAPK通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)。綜上所述,第二部分研究表明SAK-HV通過(guò)其SAK突變體功能域增強(qiáng)巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng),其機(jī)制是通過(guò)和MEKK1的自泛素化來(lái)激活JNK和ERK MAPK通路促巨噬細(xì)胞增殖;我們還提出基于Uba1的巨噬細(xì)胞增殖模型假說(shuō):SAK-HV與E1酶Uba1的相互作用,可能阻斷了 Uba1與特定E2酶的交互,從而觸發(fā)上述途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖。盡管SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)在其降脂和治療AS過(guò)程中發(fā)揮的作用尚需進(jìn)一步的研究,巨噬細(xì)胞增殖在生理、病理中發(fā)揮的關(guān)鍵作用使得對(duì)其機(jī)制的研究具有廣泛的潛在臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。本文提出的SAK-HV促巨噬細(xì)胞增殖新機(jī)制,以及基于獨(dú)特的Uba1水平泛素化調(diào)控的巨噬細(xì)胞增殖機(jī)制模型假說(shuō),為巨噬細(xì)胞增殖以及泛素化領(lǐng)域的研究提供了新的線索。
[Abstract]:A novel recombinant fusion protein , SAK - HV . SAK - HV , which is composed of SAK mutant , RGD sequence and C - terminal 12 peptide , has been studied in this study . The results showed that SAK - HV treated RAW264.7 cells and stimulated the proliferation of macrophages and vascular endothelial cells . In this paper , the new mechanism of SAK - HV stimulation for macrophage proliferation and the macrophage proliferation mechanism model based on the unique Uba1 level ubiquitination regulation are presented , which provides a new clue for the study of macrophage proliferation and ubiquitination .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R589.2;R575.5
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本文編號(hào)：1917786