本文選題：糖尿病腎病 + MicroRNAs��； 參考：《鄭州大學》2015年博士論文

【摘要】：糖尿病腎病(Diabetes nephropathy,DN)是一個主要的糖尿病微血管并發(fā)癥,是引起糖尿病患者慢性腎功能衰竭的最主要原因之一。DN病理變化主要包括系膜細胞異常增生及細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)過度堆積。在高糖狀態(tài)下,腎小球系膜細胞(Mesangial cells,MCs)功能紊亂,引起ECM蛋白分泌和降解相對失衡而大量堆積于系膜區(qū)及基底膜區(qū),使腎小球形態(tài)、結構及功能發(fā)生病理性變化,最終導致腎小球硬化癥的發(fā)生。轉化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)在MCs合成及分泌ECM的過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,高糖可激活MCs中TGF-β/Smad3信號轉導通路,最終導致膠原IV、纖連蛋白等多種ECM成分合成增加,并促進PAI-1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)表達,從而抑制ECM降解。但是,目前對導致系膜細胞損傷的確切機制尚不十分清楚。micro RNAs(mi RNAs)是由21-25個核苷酸組成的非編碼小RNAs,其可與靶基因m RNA 3′端非轉錄區(qū)域(3′-untranslated region,3′UTR)結合,通過促進m RNA降解或阻斷蛋白翻譯調(diào)節(jié)靶基因表達,從而調(diào)控機體病理生理過程。mi RNAs在細胞增殖,生長,分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。mi RNAs在不同的組織表達不同,且其表達的變化參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如腫瘤、心血管疾病、糖尿病、各種腎臟疾病等。近年大量研究表明,mi RNAs與DN發(fā)生發(fā)展密切相關,腎臟特定mi RNAs改變可以多種方式促進疾病的進展,從纖維化通路的激活到腎臟解剖學結構改變引起蛋白尿。micro RNA-27a(mi RNA-27a,mi R-27a)主要在腎臟,皮下脂肪,肺及心臟中表達,參與細胞周期、增殖及分化的調(diào)節(jié)。研究表明mi RNA-27a在1型和2型糖尿病患者的血清中表達升高,并與空腹血糖水平有較高的相關性;Herrera等運用微陣列分析發(fā)現(xiàn)在自發(fā)2型糖尿病大鼠脂肪組織及高糖培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細胞中mi RNA-27a表達明顯上調(diào);此外研究發(fā)現(xiàn)DN患者血清中mi RNA-27a明顯升高,這些研究表明mi RNA-27a在高糖環(huán)境下表達升高并且可能在糖尿病及DN的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。但是,目前國內(nèi)外缺乏對mi RNA-27a與DN腎小球MCs損傷的研究。過氧化物酶體增殖體激活受體-γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是核受體超家族成員之一,在調(diào)節(jié)腎小球系膜細胞增殖,細胞周期及糖尿病腎小球細胞外基質(zhì)合成及降解中發(fā)揮重要作用。大量研究表明,PPARγ水平增加能夠抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞及糖尿病動物模型腎臟TGF-β1的表達,減少PAI-1水平,從而抑制ECM的聚集;并且PPARγ表達升高可改善高糖誘導的系膜細胞增殖和肥大。因此增加PPARγ表達可能阻止腎小球硬化。研究表明PPARγ是mi RNA-27a的一個潛在靶基因,其3′-UTR端包含一個保守的mi RNA-27a結合位點。在低氧處理的人肺動脈內(nèi)皮細胞中,mi RNA-27a表達升高并可直接與PPARγ3′-UTR結合,負性調(diào)節(jié)其m RNA和蛋白表達水平,導致細胞增殖增加;抑制mi RNA-27a表達則可以明顯增加PPARγ表達,從而抑制細胞增殖。另外,mi RNA-27a可通過靶向結合PPARγ3′-UTR調(diào)節(jié)抑制脂肪細胞分化。因此我們推測,mi RNA-27a可能通過調(diào)節(jié)腎臟PPARγ水平影響系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積,為此,本實驗開展以下研究。第一部分mi RNA-27a在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞及糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中的表達研究目的觀察高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞及糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中mi RNA-27a的表達,初步探討mi RNA-27a與系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)堆積的關系。方法1.高濃度葡萄糖(25 mmol/L,HG)分別刺激大鼠腎小球系膜細胞(MCs)24、48、72 h,以葡萄糖濃度(5.6 mmol/L,NG)培養(yǎng)的MCs為正常對照組,Taq Man探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞mi RNA-27a水平。2.8周齡SPF級健康雄性SD大鼠,體重為(220±20)g,適應性喂養(yǎng)1周。構建糖尿病(DM)動物模型,方法如下:禁食12 h后,1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液按60 mg/kg一次性腹腔注射大鼠,正常(Control)組腹腔注射相當體積檸檬酸緩沖液,72 h后檢測血糖(Blood Glucose,BG)水平,以連續(xù)3次BG≥16.7mmol/L為DM成模標準。分別于4、8、12周末,麻醉動物,剝離腎臟,取腎上極約1mm3大小腎皮質(zhì)迅速于4%預冷戊二醛中固定用于透射電鏡觀察;另取部分腎皮質(zhì)組織置于4%多聚甲醛內(nèi)固定用于免疫組化檢測及HE染色光鏡觀察;其余腎皮質(zhì)組織快速置于液氮中,Taq Man探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞mi RNA-27a水平。結果1.與正常糖培養(yǎng)的MCs相比,mi RNA-27a在高糖培養(yǎng)的MCs中的表達明顯升高,并呈時間依賴性模式(P0.05)。2.與正常對照組相比,糖尿病大鼠腎皮質(zhì)mi RNA-27a表達水平明顯升高,并呈時間依賴性模式(P0.05)。3.腎臟組織病理學檢測結果:HE染色光鏡觀察顯示Control組大鼠腎小球結構未見明顯異常,DM組大鼠腎小球體積明顯增大,系膜細胞異常增生,腎小球系膜基質(zhì)明顯增多,基底膜異常增厚。透射電鏡超微結構顯示Control組大鼠腎小球結構清晰可見,基底膜無增厚,足細胞足突分布均勻,DM組大鼠腎小球基底膜明顯增厚,且厚薄不均一,足細胞足突逐漸融合、缺失。糖尿病大鼠腎臟上述病理變化隨糖尿病病程的延長而加劇。免疫組化結果發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎小球ECM蛋白如膠原IV、纖連蛋白表達較Control組明顯升高(P0.05),并呈時間依賴性模式。結論mi RNA-27a在高糖培養(yǎng)的腎小球MCs及STZ誘導的糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中表達明顯升高;mi RNA-27a表達的上調(diào)同時伴有腎臟肥大及系膜外基質(zhì)堆積的增加,提示mi RNA-27a可能和系膜細胞損傷有關。第二部分調(diào)節(jié)mi RNA-27a對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞PPARγ的影響研究目的探討mi RNA-27a對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞PPARγ的靶向調(diào)節(jié)作用。方法體外正常糖濃度(5.6 mmol/L)培養(yǎng)大鼠腎小球MCs,用Iipofectamine2000分別轉染mi RNA-27a mimics(mi R-27a mimics組)、mi RNA-27a inhibitors及陰性對照(NC mimics組和NC inhibitors組)。將未轉染MCs分為正常糖培養(yǎng)組(NG組)和單純高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)組(HG組)。將轉染mi RNA-27a inhibitors后的MCs培養(yǎng)于高糖(25 mmol/L)環(huán)境下(mi R-27a inhibitors組)。處理72 h后,Taq Man探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞mi RNA-27a水平;實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測PPARγm RNA水平;Western blotting法檢測PPARγ蛋白水平。細胞免疫熒光化學法檢測PPARγ的表達及分布。構建含有PPARγ-3′UTR靶標克隆野生型載體及PPARγ-3′UTR靶標克隆突變型載體(mut-PPARγ-3′UTR),將這些載體與mi RNA-27a過表達或mi RNA-27a抑制載體共轉染MCs,轉染48 h后,通過雙熒光素酶報告實驗檢測mi RNA-27a對PPARγ-3′UTR熒光活性的影響。結果1.mi R-27a mimics組MCs中mi RNA-27a的水平明顯高于NG組及NC mimics組(P0.05);mi R-27a inhibitors組MCs中mi RNA-27a的水平明顯低于HG組及NC inhibitors組(P0.05);而NG組和NC mimics組比較,HG組和NC inhibitors組比較,MCs中mi RNA-27a的水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)2.與NG組比較,HG組PPARγm RNA及蛋白水平明顯降低(P0.05);mi R-27a mimics組MCs中PPARγm RNA及蛋白水平明顯明顯低于NG組(P0.05);mi R-27a inhibitors組MCs中PPARγm RNA及蛋白水平明顯高于HG組(P0.05)。NC mimics和NC inhibitors對PPARγm RNA及蛋白水平無明顯影響(P0.05)。3.細胞免疫熒光化學結果顯示:PPARγ積聚于細胞核內(nèi),mi RNA-27a mimics可以明顯抑制PPARγ的表達(P0.05),而mi RNA-27a inhibitors則可以明顯抑制高糖誘導的PPARγ的表達下調(diào)(P0.05)。4.熒光素酶報告結果顯示:mi RNA-27a mimics可以明顯抑制PPARγ-3′UTR熒光活性(P0.05),而mi RNA-27a inhibitors則可以抑制mi RNA-27a mimics引起的PPARγ-3′UTR熒光活性的降低(P0.05)。結論mi RNA-27a可通過與PPARγ-3′UTR結合抑制PPARγ的表達。第三部分mi RNA-27a通過調(diào)節(jié)PPARγ介導高糖誘導的系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積目的探討mi RNA-27a對高糖誘導的系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積的影響及作用機制。方法1.體外正常糖濃度(5.6 mmol/L)培養(yǎng)大鼠腎小球MCs,Iipofectamin2000瞬時轉染mi RNA-27a inhibitors、PPARγsi RNA載體或共轉染mi RNA-27a inhibitors及PPARγsi RNA。將單純轉染mi RNA-27a inhibitors、共轉染mi RNA-27a inhibitors和PPARγsi RNA后的MCs培養(yǎng)于高糖(25 mmol/L)環(huán)境下。處理72h后,實時熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測各組膠原蛋白IV(Collagen IV,Col IV)、纖連蛋白(Fibronectin,FN)、TGF-β1、PAI-1的m RNA表達水平;Western blotting法檢測p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達水平;CCK-8實驗檢測細胞增殖情況;流式細胞術檢測細胞周期變化情況。2.體內(nèi)實驗通過STZ誘導建立糖尿病大鼠動物模型,運用反義寡核苷酸技術,設計合成化學修飾的antagomir-27a及mi RNA-27a antagomir陰性對照(NC antagomir)。糖尿病大鼠隨機分為3組:糖尿病未治療組,antagomir-27a治療組及NC antagomir組。以正常大鼠作為正常對照組(Control組)。每兩周監(jiān)測血糖及24 h尿蛋白變化情況。8周末,處死動物,剝離腎臟,Taq Man探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞mi RNA-27a水平;q RT-PCR檢測各組PPARγ、TGF-β1、PAI-1 m RNA水平;Western blotting法檢測PPARγ、p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達;免疫組化檢測腎小球Col IV和FN表達水平;HE染色及透射電鏡觀察腎臟病理學變化情況。結果1.與正常糖培養(yǎng)的大鼠腎小球MCs相比,高糖明顯增加MCs中Col IV、FN、TGF-β1、PAI-1的m RNA水平及p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白水平(P0.05);而mi RNA-27a inhibitors可顯著抑制高糖對上述指標的影響(P0.05);當mi RNA-27a inhibitors與PPARγsi RNA共轉染細胞時,mi RNA-27a inhibitors的作用被PPARγsi RNA阻斷(P0.05)。2.與正常糖環(huán)境下培養(yǎng)的MCs相比,高糖環(huán)境下MCs明顯增殖(P0.05);細胞周期檢測顯示G0/G1期細胞比例升高(P0.05),S期細胞比例降低(P0.05)。mi RNA-27a inhibitors干擾后MCs增殖明顯被抑制,并抑制高糖誘導的G1期細胞周期阻滯(P0.05);PPARγsi RNA則可阻斷mi RNA-27a inhibitors的上述效應(P0.05)。3.與Control組比較,糖尿病未治療組血糖水平明顯升高(P0.05),但不隨糖尿病病程的延長而逐漸增加;而antagomir-27a治療后對血糖水平無明顯影響(P0.05)。4、6、8周末,糖尿病未治療組24 h尿蛋白水平較Control組明顯升高(P0.05),且隨時間的延長而逐漸增加;antagomir-27a治療后明顯降低24h尿蛋白水平(P0.05)。4.antagomir-27a治療組腎皮質(zhì)中mi RNA-27a水平明顯低于糖尿病未治療組(P0.05),而NC antagomir對mi RNA-27a水平無明顯影響(P0.05)。5.antagomir-27a治療組腎皮質(zhì)中PPARγm RNA及蛋白水平明顯高于糖尿病未治療組(P0.05),而NC antagomir組與糖尿病未治療組比較,腎皮質(zhì)中PPARγ表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.與糖尿病未治療組相比,antagomir-27a治療組TGF-β1、PAI-1 m RNA水平明顯降低(P0.05),p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達顯著降低(P0.05)。而NC antagomir組與糖尿病未治療組比較,腎皮質(zhì)中上述指標水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.免疫組化結果顯示antagomir-27a治療組Col IV和FN水平較糖尿病未治療組明顯降低(P0.05);而NC antagomir組與糖尿病未治療組比較兩者水平無顯著性差異(P0.05)。8.HE染色顯示antagomir-27a治療組大鼠腎小球系膜細胞增生及系膜基質(zhì)增多程度均較糖尿病未治療組明顯減輕。透射電鏡超微結構顯示糖尿病未治療組大鼠基底膜明顯增厚且不光滑,足細胞足突大面積融合、缺失,系膜細胞和基質(zhì)結節(jié)性顯著增生;antagomir-27a治療組大鼠足細胞足突融合明顯改善,系膜細胞和基質(zhì)增生明顯減輕。結論1.mi RNA-27a inhibitors明顯抑制高糖誘導的腎小球MCs增殖及ECM蛋白過度堆積,其機制可能是通過調(diào)節(jié)其靶基因PPARγ水平來實現(xiàn)的。2.antagomir-27a治療明顯降低糖尿病大鼠尿蛋白水平,改善糖尿病腎臟的病理變化,減少系膜細胞增生及基質(zhì)堆積,對糖尿病腎臟起保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1917877