發(fā)布時間：2018-04-13 05:01

  本文選題：氟骨癥 + 骨轉換　； 參考：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:已有的研究表明,TGF-β超家族對成骨細胞和破骨細胞都有不同程度的調節(jié)作用。作為該家族成員之一,TGF-β1主要存在于骨組織中,對骨轉換過程起到了重要的調控作用。ALK5是TGF-β1Ⅰ型受體TβR1中的亞型受體之一,能同時激活Smad2和Smad3蛋白,參與調控骨轉換。本次實驗目的在于觀察TGF-β1及其受體信號通路與氟誘導的骨形成是否存在分子聯系,揭示并闡明TGF-β1及其受體信號通路在氟中毒骨病變發(fā)生機制中的作用,為改善氟骨癥和相關骨代謝病的防治提供理論依據和科學對策。方法及結果:實驗采用建立疾病動物模型與體外細胞培養(yǎng)相結合的方式,探討TGF-β1及其受體信號通路在氟骨癥骨轉換調控中的作用。以成年雄性Wistar大鼠為實驗對象,采用灌胃給氟兩個月的方式建立氟骨癥動物模型。染氟一個月后,腹腔注射TGF-β1亞型受體ALK5抑制劑SB431542,持續(xù)給藥一個月。染氟一月開始觀察到大鼠牙齒出現白堊色。隨著染氟濃度及時間的進一步增加,牙齒變脆易折,呈現典型的氟斑牙病變特征。用乙醚麻醉大鼠,眼球后靜脈叢取血,分離大鼠股骨、脛骨。通過觀察骨組織病理明確骨骼病變特點,確定氟骨癥模型特征。我們觀察大鼠一般體征,并使用常規(guī)和一些先進技術手段包括雙能X線骨密度儀、常規(guī)病理、免疫組化、實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及酶聯免疫吸附法等進行實驗研究分析。通過雙能X線骨密度儀分析的骨密度結果顯示,高氟組(20mg F-/kg.day)大鼠骨密度與對照組相比降低。相應地,該組大鼠板層骨排列發(fā)生紊亂,免疫組化檢測到骨鈣素OCN蛋白的表達也受到抑制�；蛩椒治霭l(fā)現高氟抑制了Runx2基因的表達,但是對RANKL基因的表達有促進作用。染氟還促進了血清中成骨、破骨相關因子PINP和CTX的表達。此外,氟刺激了Smad3基因的表達但抑制了P38MAPK基因的表達。這些結果表明投氟兩個月明顯促進了以骨吸收表現顯著為特征的骨轉換過程,并伴隨著TGF-β1下游因子Smad3表達的升高及P38MAPK表達的下降。為了探明TGF-β1和氟誘導的骨轉換之間的關系,我們加入SB431542抑制劑,觀察成骨、破骨相關因子發(fā)生哪些變化。結果顯示,單獨SB431542處理組大鼠骨密度較對照組明顯升高,氟聯合SB431542組中骨密度比相同濃度單氟處理組輕微升高,提示SB431542很可能抑制骨轉換過程提高了骨密度,這一變化趨勢在成骨、破骨基因水平上得到印證。相比于單氟處理組,SB431542聯合氟處理明顯降低了Runx2和RANKL的表達。此外,血清中PINP和CTX的表達也受SB431542的影響而降低。檢測TGF-β1相關因子的表達發(fā)現,ALK5的表達受SB431542的抑制降低,Smad3的表達明顯也低于單氟組。與對照組相比,單獨SB431542處理抑制了P38MAPK的表達。與高氟處理組相比,高氟聯合SB431542使P38MAPK的表達輕微下降。通過體內實驗結果表明TGF-β1很可能通過P38MAPK以及Smad3信號通路參與調節(jié)氟誘導的以骨吸收為主導的骨轉換過程。體外實驗我們選取破骨前體細胞RAW264.7為實驗材料,經過染氟聯合SB431542處理,進行MTT檢測及骨吸收陷窩實驗以觀察細胞活性和分化。結果顯示,與對照組相比,低氟刺激RAW264.7細胞活性。在低氟組(1mg F-/L和4mg F-/L)中骨陷窩面積增大,說明低氟對RAW264.7細胞誘導破骨方向分化具有促進作用。經過SB431542處理后,細胞增殖活性與單氟處理組相比明顯下降。在SB431542聯合低氟培養(yǎng)組中,骨陷窩面積較單氟處理組相比減小,表明SB431542處理抑制了破骨細胞分化能力。本次研究主要著重于TGF-β1在氟誘導的成骨細胞分化方面的影響,因此我們選取MC3T3-E1細胞和骨髓間充質干細胞(BMSCs)進行后續(xù)實驗。成骨前體細胞MC3T3-E1進行染氟聯合SB431542培養(yǎng)4天和7天后檢測細胞增殖活性。結果顯示低氟促進了MC3T3-E1細胞增殖,而高氟組(16mg F-/L)中細胞增殖明顯受到抑制。經過SB431542處理后,細胞增殖活性比相同濃度單氟處理組下降。此外,利用Affymetrix mi RNA 4.0芯片及相關軟件進行染氟組與對照組細胞mi RNA表達譜分析,結果表明一些已知與調控成骨密切相關的mi RNA在染氟MC3T3-E1細胞內表達顯著增加。KEGG富集分析發(fā)現氟刺激成骨細胞TGF-β1及其下游Smad3和MAPK信號通路,同時也有Hedgehog、Notch和Wnt等調控成骨細胞分化的信號通路參與,說明氟通過激活多條成骨細胞分化信號網絡來介導骨形成,驗證了TGF-β1信號通路在氟骨癥中的重要作用。體外培養(yǎng)BMSCs觀察氟聯合SB431542對成骨細胞早期分化的影響。取三周齡昆明小鼠,從股骨及脛骨中分離提取BMSCs,傳至第三代得到穩(wěn)定純化的細胞。隨后對細胞進行不同劑量染氟及聯合SB431542處理,在實驗中采用β-甘油磷酸鈉、維生素C和地塞米松誘導其向成骨方向分化。培養(yǎng)一定天數后,MTT檢測細胞增殖活性,并采用鈣鈷法和茜素紅染色觀察細胞成骨方向分化情況。同時應用免疫細胞化學染色,實時定量PCR和Western blot檢測成骨以及TGF-β1相關因子的表達。結果顯示,低劑量氟刺激細胞增殖活性,而高劑量氟則對其起到抑制作用。相比于對照組,低氟增強堿性磷酸酶活性,但高氟對堿性磷酸酶活性有抑制作用。在低氟組中,鈣鹽沉積明顯,礦化結節(jié)面積較大,而在高氟組中,礦化結節(jié)與對照組相比減少。與對照組相比,低氟刺激了Runx2基因和蛋白的表達,但在高氟組中Runx2的表達降低。此外,TGF-β1相關因子的表達也受到氟的影響發(fā)生變化。1mg F-/L濃度氟對ALK5基因的表達具有促進作用,但16mg F-/L濃度氟對其具有抑制作用。氟對Smad3基因的表達具有抑制效果,這種抑制效果隨著氟濃度的增加而增強。氟可以促進MAPK基因的表達,并且隨著氟濃度的增大,MAPK的表達逐漸升高。經過SB431542處理后,細胞增殖活性比單氟組下降,堿性磷酸酶活性減弱。在染氟聯合SB431542組中,雖然有鈣鹽沉積,但是礦化結節(jié)幾乎不見。OCN和Runx2蛋白的表達也較單氟組相比降低。實時定量PCR結果顯示,Runx2基因的表達與單氟組相比明顯降低。檢測TGF-β1相關因子的表達發(fā)現,在氟聯合SB431542處理組中,ALK5的表達與相同濃度單氟處理組相比明顯受到抑制。4mg F-/L以及16mg F-/L氟聯合SB431542處理后,MAPK的表達低于相同濃度單氟處理組。此外,Smad3基因以及Smad2/3蛋白的表達在低氟聯合SB431542組中相對下降,在高氟聯合SB431542組中相對上升。P-Smad2/3蛋白在染氟聯合SB431542處理組中較相同濃度單氟組明顯降低。這些結果說明了TGF-β1在氟刺激成骨細胞活性和分化過程中有著重要作用,TGF-β1通過介導MAPK通路正向調節(jié)這種氟作用機制,Smad3信號途徑很可能對成骨分化起到一定的負向調節(jié)。結論:體內實驗表明過量氟積累能夠造成以骨轉換加速為特征的氟骨癥。體外實驗提示氟對破骨細胞和成骨細胞活性與分化具有雙向作用,即低劑量的氟刺激兩種細胞活性和分化,而高劑量氟抑制二者活性和分化。聯合使用不同劑量氟和SB431542對大鼠和體外細胞進行處理,結果顯示TGF-β1在氟誘導的骨轉換以及刺激破骨細胞和成骨細胞活性及分化方面具有重要作用。體內、外實驗表明SB431542顯著影響了骨吸收過程以及破骨、成骨細胞分化能力,干擾了骨轉換過程。此外,基因水平分析發(fā)現TGF-β1主要通過Smad3信號途徑促進RANKL表達來介導骨吸收過程,同時通過Smad3途徑負向調控Runx2表達對成骨過程和成骨細胞分化發(fā)揮作用。相應地,本實驗還發(fā)現TGF-β1主要通過MAPK信號途徑正向介導氟刺激骨形成以及誘導成骨細胞和分化。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R599.1

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本文編號：1743015