本文選題：氟骨癥 + 骨轉(zhuǎn)換�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:已有的研究表明,TGF-β超家族對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都有不同程度的調(diào)節(jié)作用。作為該家族成員之一,TGF-β1主要存在于骨組織中,對(duì)骨轉(zhuǎn)換過(guò)程起到了重要的調(diào)控作用。ALK5是TGF-β1Ⅰ型受體TβR1中的亞型受體之一,能同時(shí)激活Smad2和Smad3蛋白,參與調(diào)控骨轉(zhuǎn)換。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察TGF-β1及其受體信號(hào)通路與氟誘導(dǎo)的骨形成是否存在分子聯(lián)系,揭示并闡明TGF-β1及其受體信號(hào)通路在氟中毒骨病變發(fā)生機(jī)制中的作用,為改善氟骨癥和相關(guān)骨代謝病的防治提供理論依據(jù)和科學(xué)對(duì)策。方法及結(jié)果:實(shí)驗(yàn)采用建立疾病動(dòng)物模型與體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方式,探討TGF-β1及其受體信號(hào)通路在氟骨癥骨轉(zhuǎn)換調(diào)控中的作用。以成年雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用灌胃給氟兩個(gè)月的方式建立氟骨癥動(dòng)物模型。染氟一個(gè)月后,腹腔注射TGF-β1亞型受體ALK5抑制劑SB431542,持續(xù)給藥一個(gè)月。染氟一月開(kāi)始觀察到大鼠牙齒出現(xiàn)白堊色。隨著染氟濃度及時(shí)間的進(jìn)一步增加,牙齒變脆易折,呈現(xiàn)典型的氟斑牙病變特征。用乙醚麻醉大鼠,眼球后靜脈叢取血,分離大鼠股骨、脛骨。通過(guò)觀察骨組織病理明確骨骼病變特點(diǎn),確定氟骨癥模型特征。我們觀察大鼠一般體征,并使用常規(guī)和一些先進(jìn)技術(shù)手段包括雙能X線骨密度儀、常規(guī)病理、免疫組化、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以及酶聯(lián)免疫吸附法等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究分析。通過(guò)雙能X線骨密度儀分析的骨密度結(jié)果顯示,高氟組(20mg F-/kg.day)大鼠骨密度與對(duì)照組相比降低。相應(yīng)地,該組大鼠板層骨排列發(fā)生紊亂,免疫組化檢測(cè)到骨鈣素OCN蛋白的表達(dá)也受到抑制�；蛩椒治霭l(fā)現(xiàn)高氟抑制了Runx2基因的表達(dá),但是對(duì)RANKL基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。染氟還促進(jìn)了血清中成骨、破骨相關(guān)因子PINP和CTX的表達(dá)。此外,氟刺激了Smad3基因的表達(dá)但抑制了P38MAPK基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明投氟兩個(gè)月明顯促進(jìn)了以骨吸收表現(xiàn)顯著為特征的骨轉(zhuǎn)換過(guò)程,并伴隨著TGF-β1下游因子Smad3表達(dá)的升高及P38MAPK表達(dá)的下降。為了探明TGF-β1和氟誘導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系,我們加入SB431542抑制劑,觀察成骨、破骨相關(guān)因子發(fā)生哪些變化。結(jié)果顯示,單獨(dú)SB431542處理組大鼠骨密度較對(duì)照組明顯升高,氟聯(lián)合SB431542組中骨密度比相同濃度單氟處理組輕微升高,提示SB431542很可能抑制骨轉(zhuǎn)換過(guò)程提高了骨密度,這一變化趨勢(shì)在成骨、破骨基因水平上得到印證。相比于單氟處理組,SB431542聯(lián)合氟處理明顯降低了Runx2和RANKL的表達(dá)。此外,血清中PINP和CTX的表達(dá)也受SB431542的影響而降低。檢測(cè)TGF-β1相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),ALK5的表達(dá)受SB431542的抑制降低,Smad3的表達(dá)明顯也低于單氟組。與對(duì)照組相比,單獨(dú)SB431542處理抑制了P38MAPK的表達(dá)。與高氟處理組相比,高氟聯(lián)合SB431542使P38MAPK的表達(dá)輕微下降。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TGF-β1很可能通過(guò)P38MAPK以及Smad3信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)氟誘導(dǎo)的以骨吸收為主導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)我們選取破骨前體細(xì)胞RAW264.7為實(shí)驗(yàn)材料,經(jīng)過(guò)染氟聯(lián)合SB431542處理,進(jìn)行MTT檢測(cè)及骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)以觀察細(xì)胞活性和分化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氟刺激RAW264.7細(xì)胞活性。在低氟組(1mg F-/L和4mg F-/L)中骨陷窩面積增大,說(shuō)明低氟對(duì)RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨方向分化具有促進(jìn)作用。經(jīng)過(guò)SB431542處理后,細(xì)胞增殖活性與單氟處理組相比明顯下降。在SB431542聯(lián)合低氟培養(yǎng)組中,骨陷窩面積較單氟處理組相比減小,表明SB431542處理抑制了破骨細(xì)胞分化能力。本次研究主要著重于TGF-β1在氟誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化方面的影響,因此我們選取MC3T3-E1細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1進(jìn)行染氟聯(lián)合SB431542培養(yǎng)4天和7天后檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示低氟促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞增殖,而高氟組(16mg F-/L)中細(xì)胞增殖明顯受到抑制。經(jīng)過(guò)SB431542處理后,細(xì)胞增殖活性比相同濃度單氟處理組下降。此外,利用Affymetrix mi RNA 4.0芯片及相關(guān)軟件進(jìn)行染氟組與對(duì)照組細(xì)胞mi RNA表達(dá)譜分析,結(jié)果表明一些已知與調(diào)控成骨密切相關(guān)的mi RNA在染氟MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著增加。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)氟刺激成骨細(xì)胞TGF-β1及其下游Smad3和MAPK信號(hào)通路,同時(shí)也有Hedgehog、Notch和Wnt等調(diào)控成骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路參與,說(shuō)明氟通過(guò)激活多條成骨細(xì)胞分化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)介導(dǎo)骨形成,驗(yàn)證了TGF-β1信號(hào)通路在氟骨癥中的重要作用。體外培養(yǎng)BMSCs觀察氟聯(lián)合SB431542對(duì)成骨細(xì)胞早期分化的影響。取三周齡昆明小鼠,從股骨及脛骨中分離提取BMSCs,傳至第三代得到穩(wěn)定純化的細(xì)胞。隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同劑量染氟及聯(lián)合SB431542處理,在實(shí)驗(yàn)中采用β-甘油磷酸鈉、維生素C和地塞米松誘導(dǎo)其向成骨方向分化。培養(yǎng)一定天數(shù)后,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,并采用鈣鈷法和茜素紅染色觀察細(xì)胞成骨方向分化情況。同時(shí)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)成骨以及TGF-β1相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果顯示,低劑量氟刺激細(xì)胞增殖活性,而高劑量氟則對(duì)其起到抑制作用。相比于對(duì)照組,低氟增強(qiáng)堿性磷酸酶活性,但高氟對(duì)堿性磷酸酶活性有抑制作用。在低氟組中,鈣鹽沉積明顯,礦化結(jié)節(jié)面積較大,而在高氟組中,礦化結(jié)節(jié)與對(duì)照組相比減少。與對(duì)照組相比,低氟刺激了Runx2基因和蛋白的表達(dá),但在高氟組中Runx2的表達(dá)降低。此外,TGF-β1相關(guān)因子的表達(dá)也受到氟的影響發(fā)生變化。1mg F-/L濃度氟對(duì)ALK5基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,但16mg F-/L濃度氟對(duì)其具有抑制作用。氟對(duì)Smad3基因的表達(dá)具有抑制效果,這種抑制效果隨著氟濃度的增加而增強(qiáng)。氟可以促進(jìn)MAPK基因的表達(dá),并且隨著氟濃度的增大,MAPK的表達(dá)逐漸升高。經(jīng)過(guò)SB431542處理后,細(xì)胞增殖活性比單氟組下降,堿性磷酸酶活性減弱。在染氟聯(lián)合SB431542組中,雖然有鈣鹽沉積,但是礦化結(jié)節(jié)幾乎不見(jiàn)。OCN和Runx2蛋白的表達(dá)也較單氟組相比降低。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,Runx2基因的表達(dá)與單氟組相比明顯降低。檢測(cè)TGF-β1相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),在氟聯(lián)合SB431542處理組中,ALK5的表達(dá)與相同濃度單氟處理組相比明顯受到抑制。4mg F-/L以及16mg F-/L氟聯(lián)合SB431542處理后,MAPK的表達(dá)低于相同濃度單氟處理組。此外,Smad3基因以及Smad2/3蛋白的表達(dá)在低氟聯(lián)合SB431542組中相對(duì)下降,在高氟聯(lián)合SB431542組中相對(duì)上升。P-Smad2/3蛋白在染氟聯(lián)合SB431542處理組中較相同濃度單氟組明顯降低。這些結(jié)果說(shuō)明了TGF-β1在氟刺激成骨細(xì)胞活性和分化過(guò)程中有著重要作用,TGF-β1通過(guò)介導(dǎo)MAPK通路正向調(diào)節(jié)這種氟作用機(jī)制,Smad3信號(hào)途徑很可能對(duì)成骨分化起到一定的負(fù)向調(diào)節(jié)。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明過(guò)量氟積累能夠造成以骨轉(zhuǎn)換加速為特征的氟骨癥。體外實(shí)驗(yàn)提示氟對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性與分化具有雙向作用,即低劑量的氟刺激兩種細(xì)胞活性和分化,而高劑量氟抑制二者活性和分化。聯(lián)合使用不同劑量氟和SB431542對(duì)大鼠和體外細(xì)胞進(jìn)行處理,結(jié)果顯示TGF-β1在氟誘導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換以及刺激破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性及分化方面具有重要作用。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明SB431542顯著影響了骨吸收過(guò)程以及破骨、成骨細(xì)胞分化能力,干擾了骨轉(zhuǎn)換過(guò)程。此外,基因水平分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1主要通過(guò)Smad3信號(hào)途徑促進(jìn)RANKL表達(dá)來(lái)介導(dǎo)骨吸收過(guò)程,同時(shí)通過(guò)Smad3途徑負(fù)向調(diào)控Runx2表達(dá)對(duì)成骨過(guò)程和成骨細(xì)胞分化發(fā)揮作用。相應(yīng)地,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TGF-β1主要通過(guò)MAPK信號(hào)途徑正向介導(dǎo)氟刺激骨形成以及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R599.1

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本文編號(hào)：1743015