本文選題：AS + 外周關(guān)節(jié)骨化��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一種骨骼及軟組織慢性進(jìn)行性炎癥性疾病。它主要對(duì)脊柱各個(gè)關(guān)節(jié)及鄰近肌腱、韌帶造成損傷。同時(shí)在不同程度上對(duì)骶髂關(guān)節(jié)和周圍關(guān)節(jié)造成慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)。在AS患者中,約有60%以上存在外周關(guān)節(jié)發(fā)病,尤以髖關(guān)節(jié)為主。隨病程進(jìn)展關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)破壞,繼而出現(xiàn)骨性強(qiáng)直乃至失去活動(dòng)功能,極大影響患者生活質(zhì)量。在AS早期病理表現(xiàn)以肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)囊等韌帶附著點(diǎn)炎癥為主,繼而軟組織受累,出現(xiàn)周圍骨侵蝕破壞。晚期附著點(diǎn)處新骨形成骨贅,在關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中形成骨橋,逐漸發(fā)展成整個(gè)關(guān)節(jié)纖維化、骨性強(qiáng)直,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,失去正�；顒�(dòng)功能。AS外周關(guān)節(jié)骨化的具體病因尚不明確。早期的觀點(diǎn)認(rèn)為它是炎癥引起的成骨機(jī)制紊亂,導(dǎo)致局部組織成骨能力增強(qiáng)。而隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制及過(guò)程的深入研究,認(rèn)為AS患者外周關(guān)節(jié)骨化是一個(gè)相互作用且多階段的復(fù)雜過(guò)程。目前對(duì)于其病因的推測(cè)有如下幾種：1.信號(hào)轉(zhuǎn)到通路異常2.炎癥作用3.應(yīng)力作用4.基因免疫異常。而目前AS外周關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直的研究主要集中于如何調(diào)控炎癥與細(xì)胞的代謝。阻止炎癥途徑,減少細(xì)胞刺激,延緩關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直的異位改變。外周關(guān)節(jié)作為人體的主要滑膜關(guān)節(jié),是AS最常累及的外周關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)滑膜覆于關(guān)節(jié)腔內(nèi)面、股骨頸周圍,包繞著關(guān)節(jié)囊內(nèi)血管,產(chǎn)生滑液,潤(rùn)滑減少關(guān)節(jié)面摩擦并為關(guān)節(jié)軟骨提供成分及運(yùn)輸代謝產(chǎn)物。而.當(dāng)滑膜病變將會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境發(fā)生明顯改變。因此,AS的外周關(guān)節(jié)發(fā)病與關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜的病理改變密切相關(guān)。在AS外周關(guān)節(jié)發(fā)病的早期患者中調(diào)查發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)腔內(nèi)即出現(xiàn)以滑膜炎為主要的臨床表現(xiàn)。通過(guò)關(guān)節(jié)鏡下或直視下行關(guān)節(jié)手術(shù)治療時(shí),發(fā)現(xiàn)患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜增生且并發(fā)滑膜炎癥性改變。同時(shí)影像學(xué)、超聲等方面的輔助檢查也為AS早期診斷提供參考依據(jù),證實(shí)滑膜病理性炎癥改變?cè)陉P(guān)節(jié)發(fā)病中的作用。隨病程進(jìn)展,在各種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用下,局部組織血管化,使滑膜、處聚集分化出了多種潛能的前體干細(xì)胞,關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞向骨性細(xì)胞分化,逐漸演變?yōu)槌晒羌?xì)胞、破骨細(xì)胞等,在這些細(xì)胞的釋放的細(xì)胞因子及相互作用下,滑膜逐漸發(fā)生骨性化生,成為新骨和骨贅的增生部位。骨硬化蛋白(sclerostin, SOST)是一種由SOST基因編碼的糖蛋白,因其存在“胱胺酸結(jié)構(gòu)”,與wnnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的共受體LRP5/6具有較高的親和性,可與LRP5/6受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,達(dá)到抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用。在對(duì)wnnt誘導(dǎo)蛋白聚合和齊聚的研究中發(fā)現(xiàn),介導(dǎo)LRP6受體可影響或增強(qiáng)wnt信號(hào)的活性。SOST和wnt信號(hào)通路聯(lián)系緊密,可能通過(guò)LRP受體影響wnt信號(hào)通路。而SOST與LRP5/6的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合拮抗wnt/β-catenin信號(hào)通路不能完全解釋SOST的抑制活性。近年來(lái)隨著SOST的研究深入,發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)增加RANKL表達(dá)調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的活性�？梢�,SOST在骨形成的活動(dòng)中作為一個(gè)廣泛的參與者而存在。本研究利用免疫組化技術(shù)將AS外周關(guān)節(jié)骨化強(qiáng)直的滑膜組織與正常人滑膜組織進(jìn)行染色比較,并通過(guò)pcr和wb檢測(cè)方法從基因和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)骨化強(qiáng)直關(guān)節(jié)滑膜中SOST和μ表達(dá)的差異,以及所代表的wnt信號(hào)通路所表達(dá)的關(guān)系,進(jìn)一步明確其在骨化發(fā)展過(guò)程中可能存在的作用。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),建立過(guò)表達(dá)SOST腺病毒載體轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞,研究過(guò)表達(dá)SOST后對(duì)滑膜細(xì)胞的成骨能力的改變,及其生理功能的異同。第一章SOST和β-catenin在AS骨化關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)及作用研究目的觀察AS外周關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直患者滑膜組織中SOST和β-catenin表達(dá),探討SOST和β-catenin在AS外周骨化關(guān)節(jié)滑膜中的作用和機(jī)理。方法1.收集AS髖關(guān)節(jié)骨化強(qiáng)直滑膜15例,股骨頸骨折髖關(guān)節(jié)滑膜18例。2.使用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)滑膜標(biāo)本進(jìn)行SOST、β-catenin特異性染色定位。3.采用Real time-PCR法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本SOST、β-catenin基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。4.采用Western-blot法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本蛋白SOST、β-catenin表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。5.免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):SOST、β-catenin以細(xì)胞漿或細(xì)胞核著色成棕黃色或者棕褐色為陽(yáng)性。采用Image-pro plus 6.0圖像處理分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化進(jìn)行定量分析,所有切片放大倍數(shù)為200x。每張切片觀察6個(gè)視野,結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD來(lái)表示。6.Real time-PCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以相對(duì)定量方法分別檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中SOST、β-catenin的基因表達(dá)值。7.Western blot結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以半定量方法,檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中SOST、 β-catenin蛋白灰度值,分別與對(duì)應(yīng)的α-tubulin蛋白灰度值比較,計(jì)算兩者比值。8.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用t檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分布取P0.05時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示：免疫組化檢測(cè)顯示SOST和β-catenin在AS滑膜組中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),主要分布于成纖維樣滑膜細(xì)胞胞漿中,且其IOD值高于正�；そM,差異有顯著性意義(P0.01)。認(rèn)為檢測(cè)指標(biāo)骨化強(qiáng)直組與正常滑膜組不同,強(qiáng)直組高于正常組；AS滑膜組織中SOST與β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.413,P0.01)。2.通過(guò)Real time-PCR檢測(cè)顯示：AS滑膜組中SOST和β-catenin基因含量大量表達(dá)。經(jīng)相對(duì)定量分析顯示：AS滑膜組的SOST和β-catenin蛋白水平顯著高于正�；そM(P0.05)。3.通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AS滑膜組中大量表達(dá)SOST和β-catenin蛋白。經(jīng)灰度值分析及半定量結(jié)果顯示：AS滑膜組的SOST和β-catenin蛋白水平顯著高于正�；そM(P0.05)。結(jié)論1.AS外周骨化關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin的異常表達(dá)與骨化相關(guān)2.AS外周骨化關(guān)節(jié)滑膜組織中其骨化能力主要在滑膜成纖維細(xì)胞上體現(xiàn)3.AS外周關(guān)節(jié)骨化其滑膜組織可能依賴于wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用第二章AS骨化關(guān)節(jié)滑膜組織中成骨作用與破骨作用的表達(dá)關(guān)聯(lián)性目的觀察AS外周關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直患者滑膜組織中OPG和RANKL蛋白及破骨細(xì)胞特異性染色TRAP的表達(dá),探討OPG和RANKL在AS外周骨化關(guān)節(jié)滑膜中與成骨作用和破骨作用的關(guān)聯(lián)性。方法1.收集AS髖關(guān)節(jié)骨化強(qiáng)直滑膜15例,股骨頸骨折髖關(guān)節(jié)滑膜18例。2.使用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)滑膜標(biāo)本進(jìn)行OPG和RANKL特異性染色定位及破骨細(xì)胞特異性染色TRAP的表達(dá)。3.采用Real time-PCR法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本OPG和RANKL基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。4.采用Western-blot法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本蛋白OPG和RANKL表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。5.免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：OPG和RANKL以細(xì)胞漿或細(xì)胞核著色成棕黃色或者棕褐色為陽(yáng)性。采用Image-pro plus 6.0圖像處理分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化進(jìn)行定量分析,所有切片放大倍數(shù)為200×。每張切片觀察6個(gè)視野,結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD來(lái)表示。6.Real time-PCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以相對(duì)定量方法分別檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中OPG和RANKL的基因表達(dá)量。7.Western blot結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以半定量方法,檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中OPG和RANKL蛋白灰度值,分別與對(duì)應(yīng)的a-tubulin蛋白灰度值比較,計(jì)算兩者比值。8.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用t檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分布取P0.05時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示：免疫組化檢測(cè)顯示OPG和RANKL在AS滑膜組中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),主要分布于成纖維樣滑膜細(xì)胞胞漿中,且其IOD值高于正常滑膜組,差異有顯著性意義(P0.05)。認(rèn)為檢測(cè)指標(biāo)骨化強(qiáng)直組與正�；そM不同,強(qiáng)直組高于正常組；2.破骨細(xì)胞特異性TRAP染色在AS組滑膜中表達(dá)較正常滑膜組明顯增高。3.通過(guò)Real time-PCR檢測(cè)顯示：AS滑膜組中大量表達(dá)OPG的基因,而RANKL未見明顯升高。經(jīng)相對(duì)定量分析顯示：AS滑膜組的OPG基因水平顯著高于正�；そM(P0.05)。4.通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AS滑膜組中大量表達(dá)OPG蛋白,而ANKL未見明顯升高。經(jīng)灰度值分析及半定量結(jié)果顯示：AS滑膜組的OPG蛋白水平顯著高于正�；そM(P0.05)。結(jié)論1.AS外周關(guān)節(jié)的骨化強(qiáng)直過(guò)程可與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞密切相關(guān),其中成骨細(xì)胞在骨化中發(fā)揮主要作用。2.AS外周骨化關(guān)節(jié)的滑膜組織中表達(dá)以成骨能力為主的作用。3.AS外周骨化關(guān)節(jié)的滑膜組織中破骨能力或受到抑制。第三章轉(zhuǎn)染SOST基因后對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞的wnt通路功能影響及成骨作用與破骨作用表達(dá)關(guān)聯(lián)性研究目的探討人成纖維樣滑膜細(xì)胞(human fibroblast-like synoviocytes,HFLS)過(guò)表達(dá)骨硬化蛋白(sclerostin, SOST)后,細(xì)胞功能的改變及SOST所依賴的wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞的作用影響。HFLS過(guò)表達(dá)SOST后,細(xì)胞功能變化及其成骨作用和破骨作用的表達(dá)關(guān)聯(lián)性。方法1.將HFLS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、飽和濕度計(jì)含5%C02的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。2.用攜帶SOST基因的腺病毒感染成纖維樣滑膜細(xì)胞作為過(guò)表達(dá)組,同時(shí)設(shè)立空白載體組及空白組作為對(duì)照,72h后熒光顯微鏡檢測(cè)基因的表達(dá)情況確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率,5天后檢測(cè)SOST、β-catenin、OPG和RANKL基因及蛋白的表達(dá)變化3.采用Real time-PCR法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本SOST-β-catenin、OPG和RANKL基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。4.采用Western-blot法對(duì)滑膜標(biāo)本樣本蛋白SOST、β-catenin、OPG和RANKL表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。5.Real time-PCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以相對(duì)定量方法分別檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中SOST、β-catenin、OPG和RANKL的基因表達(dá)量。6.Western blot結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以半定量方法,檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中SOST、 β-catenin、OPG和RANKL蛋白灰度值,分別與對(duì)應(yīng)的a-tubulin蛋白灰度值比較,計(jì)算兩者比值。7.數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用t檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分布取P0.05時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.realtime-PCR結(jié)果顯示：與空白組及空白載體組相比,過(guò)表達(dá)組SOST、 β-catenin、OPG基因表達(dá)量與空白組及空白載體組存在顯著差異,過(guò)表達(dá)組高于空白載體組及空白對(duì)照組,差異有顯著性意義(P0.05)。過(guò)表達(dá)組RANKL基因表達(dá)量與空白組及對(duì)照組存在顯著差異,且低于空白載體組及空白對(duì)照組(p0.05)2.Western blot結(jié)果顯示：與空白組及空白載體組相比,過(guò)表達(dá)組SOST、 β-catenin、OPG蛋白表達(dá)量與空白組及空白載體組存在顯著差異,過(guò)表達(dá)組高于空白載體組及空白對(duì)照組,差異有顯著性意義(P0.05)。過(guò)表達(dá)組RANKL蛋白表達(dá)量與空白組及對(duì)照組存在顯著差異,且低于空白載體組及空白對(duì)照組(p0.05)結(jié)論1.滑膜組織中SOST過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致wnt/β-catenin信號(hào)的活化。2.滑膜組織中SOST過(guò)表達(dá)可使成骨作用增強(qiáng),破骨作用減弱。3成纖維樣滑膜細(xì)胞可能是AS滑膜發(fā)生骨化強(qiáng)直病理改變的作用細(xì)胞。
[Abstract]:In the early stage of AS , it is believed that the peripheral joint ossification of AS patients is a major clinical manifestation of inflammation . In recent years , the expression of SOST and 尾 - catenin in synovial tissue of AS was investigated .
The expression of SOST and 尾 - catenin in synovial tissue of AS synovium was significantly higher than that in normal synovium ( P0.05 ) .
2 . The expression of OPG in synovial tissue of AS was significantly higher than that in normal synoviocytes ( P0.05 ) . Compared with blank group and blank control group , the expression level of SOST , 尾 - catenin and OPG was significantly different from blank group and blank control group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.23

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本文編號(hào)：1734253