發(fā)布時(shí)間：2018-04-08 19:19

  本文選題：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎　切入點(diǎn)：共同表位　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,常導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和殘疾。發(fā)病機(jī)制尚不十分明確,與遺傳、環(huán)境因素及自身免疫功能紊亂等有關(guān)。其中遺傳因素約起到了60%的作用,HLA-DRB1等位基因編碼的五氨基酸序列QKRAA, QRRAA或RRRAA與該病關(guān)系密切,被稱為共同表位(shared epitope, SE)。共同表位學(xué)說由PETER K.等于1987年提出,通常指在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中高表達(dá),由HLA-DRB1某些等位基因編碼的一段高度保守的五氨基酸序列,這段序列位于這些DRB1等位基因編碼的β鏈第三高變區(qū)的70-74位。共同表位存在三個(gè)同源的氨基酸序列：1、QKRAA主要由HLA-DRB1*0401等位基因編碼；2、QRRAA,主要由HLA-DRB1*0404. HLA-DRB1*0101和HLA-DRB1*0405等位基因編碼；3、RRRAA,由HLA-DRB1*1001等位基因編碼,其中QKRAA在白種人中最常見,RRRAA在所有人群中最為罕見。多項(xiàng)國內(nèi)外研究已表明,HLA-DRB1共同表位與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性及疾病嚴(yán)重度均具有相關(guān)性。此外,編碼共同表位的HLA-DRB 1等位基因具有等位基因劑量效應(yīng),即純合子(有2個(gè)編碼共同表位的等位基因)患者往往較雜合子(有1個(gè)編碼共同表位的等位基因)疾病嚴(yán)重度更高,同理,雜合子患者較無編碼共同表位等位基因的患者疾病程度嚴(yán)重。然而,這些研究多基于遺傳學(xué)研究,共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中起到何種作用,其機(jī)制如何,目前尚不明確。除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外,多項(xiàng)研究表明HLA-DRB1共同表位與其他疾病相關(guān)。人類疾病中,風(fēng)濕性多肌痛、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、I型糖尿病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、狼瘡、自身免疫性肝炎以及早發(fā)性慢性淋巴性白血病相關(guān)。另外,HLA-DRB 1共同表位與犬的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。在HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中,共同表位與自發(fā)糖尿病的發(fā)病率、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎及自身免疫性腦脊髓炎的疾病嚴(yán)重度相關(guān)。然而,同樣與HLA-DRB1有著相關(guān)性的強(qiáng)直性脊柱炎是否與共同表位相關(guān),目前未見報(bào)道。因此,本研究旨在探討HLA-DRB1共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中介導(dǎo)的免疫反應(yīng),以及HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)系。第一部分：HLA-DRBl共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中對(duì)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的作用目的觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)共同表位的免疫反應(yīng),探討共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機(jī)理。方法1.采集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血18例,健康人外周靜脈血17例。2.使用Q IAGEN DNA抽提試劑盒,從外周血中抽提DNA。3.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB 1基因分型,先進(jìn)行HLA-DRB1*01.HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01.HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型,根據(jù)PCR條帶確定基因型。4.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離收集,采用密度梯度離心法(Ficoll分離)。5.將PBMC分為五組,分別加入刺激物刺激6小時(shí)。第一組為陽性對(duì)照組,加入佛波酯(PMA)和離子霉素(Ionomycin)；第二組加入HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)；第三組加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)；第四組加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)；第五組加入培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。6.PBMC使用熒光染料標(biāo)記表面標(biāo)志CD3+和CD4+,破膜,熒光染料標(biāo)記胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以IFN-γ、IL-17陽性反應(yīng)細(xì)胞占比表示。7.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,多組數(shù)據(jù)間的比較采用Kruskal-Wallis Test,兩組數(shù)據(jù)間的比較采用Nemenyi Testo顯著性檢驗(yàn)P0.05,即判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.基因分型結(jié)果顯示：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者共同表位陽性共9例,其中基因型為HLA-DRB 1*0401的2例,HLA-DRB1*0405的7例；共同表位陰性9例。健康人共同表位陽性3例,基因型均為HLA-DRB 1*0405;共同表位陰性14例。2.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中,HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.06±0.04%, CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.16±0.16%；HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.11±0.04%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.26±0.11%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.04+0.02%, CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.20±0.07%。H LA-DRB 1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB 1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.05±0.05%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.70±0.10%；HLA-DRB 1*040 5者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.43±0.09%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.40±0.11%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.03±0.01%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.27±0.09%。HLD-DRB 1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.02±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.18±0.07%；HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.05±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.07±0.03%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.02±0.01%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.09±0.02%。3.健康人中,HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.02±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.10±0.05%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.07±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.10±0.04%。HLA-DRB 1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.09±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.19±0.08%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.07±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.15±0.06%。HLD-DRB 1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.02±0.01%,CD3+CD4+IL-17+ T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.12±0.10%；共同表位陰性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.05±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例為0.18±0.08%。4.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中,共同表位陽性者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生INF-γ的比例有顯著性差異(P=0.0150.05),基因型對(duì)應(yīng)肽段刺激高于另外兩組肽段刺激(P=0.0350.05和P=0.0030.05),有顯著性差異。共同表位陽性患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IL-17的比例無顯著性差異(P=0.0530.05)；共同表位陰性者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的比例無顯著性差異(P=0.3540.05和P=0.3480.05)。健康人中,共同表位陽性和陰性者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IFN-Y和IL-17的比例均無顯著性差異(P=0.0950.05和P=0.6510.05；P=0.6230.05和P=0.9320.05)。結(jié)論1.HLA-DRB1共同表位可刺激共同表位陽性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-Y,導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以及疾病嚴(yán)重程度的加重。2.在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中,HLA-DRB1共同表位不能刺激CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。第二部分：]HLA-DRB1共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中對(duì)CD11C+CD8-樹突狀細(xì)胞的作用目的觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者C D11C+CD8-樹突狀細(xì)胞(DCs)對(duì)共同表位的免疫應(yīng)答,探討共同表位在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機(jī)理。方法1.收集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血12例。2.使用QIAGEN DNA抽提試劑盒,從外周血中抽提DNA。3.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB1基因分型,先進(jìn)行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型,根據(jù)PCR條帶確定基因型。4.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離收集,采用密度梯度離心法(Ficoll分離)。5.采用貼壁法培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞(DCs),分別于第1、3、5天加入GM-CSF、IL-4,第6天收集DCs。6.熒光染料標(biāo)記DCs表面標(biāo)志CD11c、CD83,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。7.將DCs分為五組,分別加入刺激物刺激6小時(shí)。第一組為陽性對(duì)照組,加入TNF-α：第二組加入HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)；第三組加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)；第四組加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五組加入培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。8.熒光染料標(biāo)記DCs,選擇CD11c+CD8-細(xì)胞,破膜,熒光染料標(biāo)記胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-6,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以IL-6陽性反應(yīng)細(xì)胞占比表示。9.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析,多組數(shù)據(jù)之間的比較采用Kruskal-Wallis Test.顯著性檢驗(yàn)P0.05,即判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.基因分型結(jié)果顯示：共同表位陽性6例,其中基因型為HLA-DRB1*0401的2例,HLA-DRB1*0405的4例；共同表位陰性6例。2.培養(yǎng)至第6天的DCs表型鑒定CDllc的比例為89.74±2.80%,CD83+的比例為6.81±1.04%,結(jié)合鏡下形態(tài),為未成熟DCs。3. HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKR A AVDTYC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD 11 c+CD8-IL-6+DCs的比例為0%HLA-DRB1*0405者CD11c+CD8-DCs產(chǎn)生IL-6的比例為1.66±0.32；共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.83±0.46%。HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后,]HLA.DRB1*0401者CD 11 c+CD8.IL-6+DCs的比例為0.04±0.04%；HLA-DRB1*0405者 CD11c+CD8-IL-6+DCs比例為0.11±0.07%；共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.52±0.18%。HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB1*0401純合者CD11 c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.03±0.03%；HLA-DRB1*0405純合者 CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.11±0.11%；共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs比例為0.26±0.17%。4.共同表位陽性和陰性者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者其CD11c+CD8-DCs經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IL-6的比例均無顯著性差異(P=0.3040.05和P=0.3540.05)。結(jié)論在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中,]HLA-DRB 1共同表位不能刺激CD11c+CD8-樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。第三部分：]HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)系目的探討HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)聯(lián)性。方法1.采集182例強(qiáng)直性脊柱炎患者的DNA樣本。健康對(duì)照組數(shù)據(jù)采用第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院風(fēng)濕免疫科實(shí)驗(yàn)室對(duì)404名健康人的HLA-DRB1基因分型結(jié)果。2.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB 1基因分型,先進(jìn)行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型,根據(jù)PCR條帶確定基因型。3.應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Chi-square Test檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)P0.05,認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.強(qiáng)直性脊柱炎患者中,共同表位陽性者37例,比例為20.33%；健康人中,共同表位陽性者91例,比例為22.52%。2.強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康人比較,HLA-DRB1共同表位陽性比例無明顯差異(P=0.560.05)。結(jié)論HLA-DRB 1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎無明顯關(guān)聯(lián).
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.2

【共引文獻(xiàn)】

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1 呂翠翠;曹慧;徐斐;;HLA-DR4分子與抗類風(fēng)濕性免疫活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2015年09期

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本文編號(hào)：1723004