本文選題：黃芪多糖　切入點(diǎn)：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最為嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一,嚴(yán)重者易引發(fā)終末期腎衰竭(end stage renal disease,ESRD),其發(fā)病機(jī)制主要有糖脂代謝紊亂、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、氧化應(yīng)激損傷、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子及偶聯(lián)信號通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)異常等。micro RNA是一種由19~25個(gè)核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,能夠在m RNA的翻譯過程中負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)。micro RNA的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供了新的契機(jī)。NOX4(NADPH oxidase 4,NOX4)是NADPH氧化酶在腎臟中的主要活性亞基,它的異常激活能夠引發(fā)氧化應(yīng)激損傷,另外,NOX4/PKC/Rho A/ROCK形成了相互循環(huán)的作用機(jī)制,共同調(diào)節(jié)糖尿病腎病的發(fā)病過程。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)具有降糖、改善胰島素抵抗、提高胰島素敏感性、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等活性,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,HUCMSCs)具有橫向分化、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)的作用,二者在糖尿病的治療中均取得了較大的研究進(jìn)展,但APS聯(lián)合HUCMSCs共同干預(yù)治療糖尿病大鼠腎損傷的研究尚未見有國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。目的:本研究以APS聯(lián)合HUCMSCs共同干預(yù)治療糖尿病大鼠,觀察并檢測其對糖尿病大鼠糖脂代謝、腎功能、氧化應(yīng)激及腎臟病理形態(tài)學(xué)的改善作用,并從micro RNA角度探討其作用機(jī)制。方法:Wistar大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備糖尿病模型,隨機(jī)分為DN組,APS組(APS 12.5g/kg,1次/d),MSCs組(HUCMSCs 2×106個(gè)/只,1次/2 w),A+M組(APS 12.5g/kg,1次/d;HUCMSCs 2×106個(gè)/只,1次/2 w),Gli組(格列本脲1.5mg/kg,1次/d),Bena組(貝那普利12mg/kg,1次/d),另設(shè)Con組為正常對照組,連續(xù)給藥12 w。通過對各組大鼠的糖脂代謝、腎功能、抗氧化能力及腎臟病理形態(tài)學(xué)檢測(HE染色、PAS染色和免疫組織化學(xué)染色),探討APS聯(lián)合HUCMSCs對糖尿病大鼠腎臟病變的改善作用。另外,采用micro RNA芯片技術(shù)獲得Con、DN及A+M組大鼠腎組織micro RNA差異表達(dá)譜,篩選各組間特異性表達(dá)的micro RNAs,并以real-time PCR檢測其相對表達(dá)量。以生物信息學(xué)軟件預(yù)測micro RNA靶基因并行功能分析,并通過免疫組織化學(xué)法及western blot實(shí)驗(yàn)檢測其靶蛋白及偶聯(lián)信號通路中關(guān)鍵蛋白的相對表達(dá)量,進(jìn)一步研究APS聯(lián)合HUCMSCs改善糖尿病大鼠腎臟病變可能的作用機(jī)制。結(jié)果:1、DN組大鼠表現(xiàn)出明顯的“三多一少”癥狀,血糖值明顯高于正常水平,尿BUN、UAER、UAlb及血清BUN水平明顯升高,CCR水平明顯降低,血脂T-CHO、TG、LDL-C水平明顯升高,HDL-C含量明顯降低(P0.01),表明DN組大鼠的糖脂代謝及腎功能出現(xiàn)紊亂。治療組以上各指標(biāo)均呈現(xiàn)不同程度的改善,其中A+M組大鼠的血糖、UAER、UAlb、血清BUN、CCR及T-CHO、TG、LDL-C較其他治療組改善最為明顯,提示APS聯(lián)合HUCMSCs能顯著改善糖尿病大鼠的糖脂代謝及腎功能,并優(yōu)于單獨(dú)給予APS和HUCMSCs治療組。2、DN組大鼠的血清及腎組織勻漿中T-SOD、T-AOC、CAT及GSH-PX水平較Con組顯著降低,MDA含量顯著升高(P0.01),表明DN組大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。治療組大鼠以上氧化應(yīng)激指標(biāo)呈現(xiàn)不同程度的改善,其中A+M組大鼠血清及腎組織勻漿中以上指標(biāo)改善最為明顯,優(yōu)于單獨(dú)給予APS和HUCMSCs治療組。3、DN組大鼠腎臟組織切片呈現(xiàn)出明顯的病理改變,腎小球體積增大,毛細(xì)血管基底膜增厚,系膜細(xì)胞增生,糖原陽性染色區(qū)域增多,細(xì)胞外基質(zhì)積聚,FN和Col IV表達(dá)量升高。各治療組中A+M組腎臟形態(tài)學(xué)改善最為顯著,優(yōu)于單獨(dú)給予APS和HUCMSCs治療組,腎小球未見明顯肥大,系膜細(xì)胞未見明顯增生,基底膜未見明顯增厚,糖原表達(dá)降低,細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分FN、Col IV的表達(dá)量無明顯增多。4、micro RNA芯片結(jié)果顯示,與Con組相比,DN組大鼠腎組織中分別有15/6個(gè)micro RNAs表達(dá)上調(diào)/下調(diào);與DN組相比,A+M組大鼠的腎組織中分別有21/19個(gè)micro RNAs表達(dá)上調(diào)/下調(diào)。real-time PCR結(jié)果表明rno-mi R-208a-3p、rno-mi R-363-5p在DN組中表達(dá)明顯高于Con組,與DN組相比A+M治療組表達(dá)顯著降低(P0.01)。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)與rno-mi R-208a-3p相關(guān)的基因有146個(gè),與rno-mi R-363-5p相關(guān)的基因有678個(gè)。5、發(fā)現(xiàn)NOX4作為rno-mi R-363-5p的靶基因之一,介導(dǎo)了NOX4/PKC/Rho A/ROCK信號通路。免疫組織化學(xué)及western blot結(jié)果顯示NOX4、PKCβ、Rho A、ROCK1在DN組腎臟中表達(dá)量顯著升高,在A+M組中表達(dá)明顯低于DN組。根據(jù)研究結(jié)果得出以下結(jié)論:1.APS聯(lián)合HUCMSCs能夠顯著改善糖尿病大鼠的糖脂代謝、腎功能、氧化應(yīng)激水平及腎臟病理改變,且效果優(yōu)于單獨(dú)給予APS和HUCMSCs。2.APS聯(lián)合HUCMSCs能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠腎臟rno-mi R-208a-3p及rno-mi R-363-5p的表達(dá)。3.APS聯(lián)合HUCMSCs能夠抑制腎組織中NOX4活性,調(diào)節(jié)NOX4/PKC/Rho A/ROCK信號通路,且其作用優(yōu)于單獨(dú)給予APS和HUCMSCs。4.APS聯(lián)合HUCMSCs對糖尿病大鼠腎臟病變的改善作用可能是通過或部分通過調(diào)節(jié)腎臟中rno-mi R-363-5p的表達(dá),抑制NOX4活性進(jìn)而抑制NOX4/PKC/Rho A/ROCK信號通路的激活實(shí)現(xiàn)的。創(chuàng)新點(diǎn):本研究首次觀察了APS聯(lián)合HUCMSCs對糖尿病大鼠腎臟病變的改善作用,并從micro RNA角度探討了其作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)APS聯(lián)合HUCMSCs能下調(diào)糖尿病大鼠腎組織中rno-mi R-363-5p的表達(dá),抑制靶基因NOX4活性,抑制腎小球細(xì)胞中PKCβ表達(dá),阻礙Rho A/ROCK信號通路的激活,改善糖尿病腎臟病變。
[Abstract]:Diabetic nephropathy ( DN ) is one of the most serious complications of diabetic nephropathy in diabetic nephropathy . Methods : To investigate the effect of APS combined with HUCMSCs on diabetic nephropathy in diabetic rats . Compared with Con group , the levels of T - SOD , T - AOC , CAT and GSH - PX in diabetic rats were significantly lower than that in Con group . The expression of rno - mi R - 363 - 5p in diabetic rats was detected by APS combined with HUCMSCs . The results showed that APS combined with HUCMSCs could significantly improve the expression of rno - mi R - 363 - 5p in diabetic rats .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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