本文關鍵詞：內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物與1型糖尿病大鼠心功能及心肌線粒體功能障礙，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中南大學》 2012年

內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物與1型糖尿病大鼠心功能及心肌線粒體功能障礙

潘瑤  

【摘要】：一、研究背景和目的 糖尿病是嚴重危害人類健康的常見疾病,糖尿病并發(fā)心血管疾病,尤其是糖尿病心肌病已成為糖尿病病人死亡的重要原因。然而,其發(fā)病機制不清楚。糖尿病心肌病是一類不依賴動脈粥樣硬化和高血壓存在的特殊性、非缺血性心肌病。臨床最早出現(xiàn)左心室舒張功能障礙,并左心室順應性降低和左心室肥厚；然后發(fā)展為收縮功能障礙,左心室擴張并出現(xiàn)各種心律失常以致心力衰竭。糖尿病心肌病的主要病理改變是心肌微血管內(nèi)皮細胞損害、內(nèi)膜下纖維增生、毛細血管基底膜增厚、間質(zhì)炎癥、心肌纖維化、心肌細胞凋亡等。臨床上糖尿病主要分為1型和2型糖尿�。浑m然臨床上90%的糖尿病都是2型糖尿病,但1型糖尿病大多發(fā)病早,在青少年期間就發(fā)病,故病程長；而且治療上依賴胰島素,因此更易并發(fā)心血管并發(fā)癥。越來越多的文獻報道,糖尿病心肌病與線粒體功能障礙密切相關；我室近年來也研究發(fā)現(xiàn),在高脂飼養(yǎng)加小劑量的鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射誘導的2型糖尿病大鼠,血中內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非對稱二甲基精氨酸(ADMA)明顯升高,并與心肌線粒體功能障礙和線粒體生物合成降低有關；但未同步檢測糖尿病大鼠心功能的變化。因此,本研究擬在STZ誘導的1型糖尿病大鼠,進一步探討內(nèi)源性ADMA升高與糖尿病心功能不全和心肌線粒體功能障礙三者之間的關系,為闡明糖尿病心肌病的發(fā)病機制提供新的實驗數(shù)據(jù)。 二、方法 1、動物實驗：給兩月齡體重在200～220g的雄性SD大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(65mg/kg,溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液,pH4.2)以制備1型糖尿病大鼠模型；采用頸動脈插管至左心室直接檢測血流動力學和心功能指標的變化；測定心肌組織ATP含量,用RT-PCR檢測心肌組織解偶聯(lián)蛋白(UCP2)的轉(zhuǎn)錄水平；用PCR及RT-PCR測定心肌組織線粒體基因：細胞色素C氧化酶亞基I(COX I)與核基因：β-actin拷貝數(shù)的比值以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ線粒體生物合成；用高效液相色譜測定大鼠血清中ADMA濃度,用Western blotting檢測心肌ADMA的主要合成酶：蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)和ADMA主要代謝酶：二甲基精氨酸-甲胺水解酶(DDAH),以及內(nèi)皮型NOS (eNOS)和誘導性NOS (iNOS)蛋白表達,用比色法測定心肌組織DDAH及NOS活性以及NO代謝產(chǎn)物含量,以反映心肌組織PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路的變化；還測定心肌組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物：丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶：超氧化物岐化酶(SOD)活性以反應氧化應激。 2、細胞實驗用內(nèi)源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L-硝基精氨酸(L-NNA)或L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)孵育培養(yǎng)的大鼠心肌細胞株H9C2細胞48h,然后用Western blotting檢測心肌細胞中PRMT1/DDAH/ADMA/NOS通路蛋白的表達改變。 三、結(jié)果 1、動物實驗：與正常大鼠相比,STZ誘導的1型糖尿病大鼠血糖明顯升高,尿糖呈強陽性,體重明顯下降,心臟質(zhì)量也下降,使心指數(shù)(HMI)相對增加；糖尿病模型大鼠心率(BPM)比正常大鼠明顯減慢,心動周期延長,收縮期也延長；左心室等容舒張壓平均變化速率(IRP Average dp/dt)明顯降低,舒張期左心室內(nèi)壓下降最大變化速率(Min dp/dt)也顯著減慢,反應糖尿病大鼠心臟舒張功能明顯損害；此外,左心室收縮壓(Max pressure)降低,舒張壓(Min pressure)升高,左心室舒張末壓(EDP)也升高,這些指標雖無統(tǒng)計學上的顯著性,但是左心室發(fā)展壓(Max-Min pressure)明顯降低,提示心臟收縮功能也受到輕度損害。與正常對照組大鼠比較,糖尿病大鼠心肌組織反映線粒體DNA含量的COX Ⅰ/β-actin比值明顯降低,線粒體生物合成的關鍵調(diào)節(jié)因子即PGC-1α的轉(zhuǎn)錄下調(diào),表示糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成減少；解偶聯(lián)蛋白UCP2轉(zhuǎn)錄水平升高,但是心肌組織ATP含量卻是增加的。與正常對照組大鼠比較,糖尿病大鼠血清中ADMA濃度明顯升高,心肌組織DDAH活性有降低趨勢,NOS活性明顯無變化,iNOS活性增加,NO代謝產(chǎn)物增加；糖尿病大鼠心肌組織ADMA的主要產(chǎn)生酶PRMT1蛋白表達上調(diào),而主要分布在心血管系統(tǒng)的ADMA主要代謝酶DDAH2的蛋白表達則降低,DDAH1表達無明顯改變；iNOS表達上調(diào),而eNOS表達降低,提示糖尿病時內(nèi)源性ADMA升高是由于其生成酶PRMT1上調(diào)和其代謝酶DDAH2表達下調(diào)所致。經(jīng)相關性分析,內(nèi)源性ADMA濃度與左心室發(fā)展壓(Max-min pressure)呈負相關,而與左室舒張壓下降的最大速率(Min dp/dt)呈正相關；此外,內(nèi)源性ADMA濃度還與線粒體DNA含量或線粒體生物合成呈負相關,而與UCP2轉(zhuǎn)錄水平呈正相關。 2、細胞實驗結(jié)果：用內(nèi)源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L-NNA或L-NAME孵育培養(yǎng)的大鼠心肌細胞株H9C2細胞48h,明顯增加ADMA主要生成酶PRMT1表達,降低ADMA主要代謝酶DDAH1和DDAH2的表達,上調(diào)iNOS表達,而eNOS表達無明顯變化；此結(jié)果與糖尿病大鼠心肌組織PRMT1/DDAH/NOS通路的蛋白表達一致。 四、結(jié)論 1、糖尿病大鼠內(nèi)源性NOS抑制物ADMA含量明顯增加,可能是由于其合成酶PRMT1的蛋白表達上調(diào)和其主要代謝酶DDAH2的蛋白表達下調(diào)所致； 2、糖尿病大鼠心臟舒張功能明顯損害,收縮功能輕度受損； 3、糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成明顯抑制,可能是其主要調(diào)節(jié)因子PGC-1α轉(zhuǎn)錄下調(diào)所致； 4、糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA升高與心臟舒張和收縮功能損害有關；亦與心肌線粒體生物合成呈負相關,與UCP2上調(diào)呈正相關。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R587.1
【目錄】：

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