本文關鍵詞：磷酸化FoxO1在高糖誘導人腎小管上皮細胞脂質沉積中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學》 2014年

磷酸化FoxO1在高糖誘導人腎小管上皮細胞脂質沉積中的作用

李凡  

【摘要】：目的：糖尿病腎�。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，超過30％的終末期腎功能衰竭是由糖尿病所致。糖尿病腎病在病理學上主要表現(xiàn)為腎小球系膜細胞肥大、細胞外基質分泌、腎小球硬化、腎小管上皮細胞轉分化、腎小管間質纖維化和足細胞凋亡等，其發(fā)病機制涉及到許多方面，包括高血糖、高血流灌注、炎癥因子、免疫損傷、氧化應激和血脂異常等。有學者認為腎臟固有細胞脂質合成的增多導致腎臟內脂質積聚在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本研究室前期實驗證實高糖刺激人腎小管上皮細胞，可通過激活PI3K/Akt信號通路上調脂代謝相關蛋白ADRP和FAS的表達介導糖尿病腎臟脂質積聚，而應用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002阻斷Akt激活后，細胞內脂滴形成明顯減少，提示PI3K/Akt通路參與了糖尿病腎小管上皮細胞的脂質沉積，然而PI3K/Akt通路調控糖尿病腎臟脂質沉積的具體機制尚未完全闡明。PI3K/Akt通路下游有許多目標基因，包括Bad、FoxO1、mTOR、PRAS40和GSK-3β，其中叉頭框蛋白1（forkhead transcription factors of Oclass1，F(xiàn)oxO1）廣泛分布于機體的各類組織和細胞中，其上游主要受PI3K/Akt信號通路調控，活化的Akt可使FoxO1發(fā)生磷酸化由核內輸出至胞漿而失去轉錄活性。有關FoxO1在糖尿病中的研究揭示高糖可刺激腎臟固有細胞PI3K/Akt信號通路激活，活化的Akt使FoxO1磷酸化，核內FoxO1減少。PI3K/Akt激酶抑制劑LY294002刺激細胞時FoxO1的亞細胞定位主要位于核內, FoxO1總蛋白水平?jīng)]有顯著的變化，磷酸化水平降低。提示FoxO1作為PI3K/Akt通路的下游因子參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展。但是目前有關FoxO1與糖尿病腎臟脂質沉積的關系鮮有報道。 脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是體內脂肪合成途徑中的一個關鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰CoA合成內源性長鏈脂肪酸。脂肪分化相關蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）是一種主要的脂滴蛋白，位于多種細胞脂滴表面，是脂滴的主要成分之一，在脂滴很小時可檢測出ADRP的表達。油紅O染色是公認的檢測細胞內脂滴的方法，靈敏度較高。本實驗以FAS和ADRP表達量的變化及油紅O紅染脂滴顆粒作為檢測脂質代謝的變化。 本研究通過高糖刺激體外培養(yǎng)的人腎小管細胞并轉染野生型FoxO1質粒及Ser256位點發(fā)生突變的FoxO1質粒，，觀察FoxO1、p-FoxO1、ADRP蛋白表達量和FAS mRNA變化，初步探討p-FoxO1與糖尿病腎小管上皮細胞脂質沉積的關系。 方法：人腎小管上皮細胞（HK2）在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內用含10%的胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。①采用CaCl2法制備DH5a感受態(tài)細胞，F(xiàn)oxO1野生型重組質粒及256位點突變的FoxO1質粒轉化感受態(tài)細胞，搖菌擴增后提取質粒。②細胞同步化后隨機分為兩組：正常對照組（5.5mmol/L葡萄糖）和高糖組（25mmol/L葡萄糖）。高糖刺激48小時后終止培養(yǎng)，分別進行蛋白質、RNA提取及油紅O染色，Western blot檢測FoxO1、p-FoxO1（Ser256）及ADRP蛋白表達；Real-time PCR檢測細胞內FAS mRNA的表達；油紅O觀察細胞內脂滴變化。③野生型及突變型FoxO1質粒轉染實驗，細胞隨機分為4組：空白細胞對照組、pcDNA3.1空質粒對照組、pcDNA3.1-wt FoxO1質粒轉染組和pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）質粒轉染組。轉染采用陽離子脂質體法，轉染后高糖刺激48小時，采用Western blot檢測FoxO1、p-FoxO1（Ser256）及ADRP蛋白表達；Real-time PCR檢測細胞內FAS mRNA的表達；油紅O觀察細胞內脂滴變化。 結果： 1．高糖對人腎小管上皮細胞FoxO1、p-FoxO1、ADRP和FAS表達的影響 Western blot檢測顯示正常對照組和高糖組HK2細胞總FoxO1表達未見明顯差異，定量分析條帶積分光密度比值分別為0.64±0.10和0.69±0.06；磷酸化FoxO1（即失活狀態(tài)的FoxO1）在兩組間表達不同，高糖組明顯高于正常對照組，相對表達量分別為0.43±0.04和0.23±0.04，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；ADRP表達高糖組明顯高于正常對照組，分別為0.66±0.22和1.19±0.20，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。應用Real-time PCR技術進行細胞內FAS mRNA表達的檢測，高糖組表達明顯高于正常對照組，是正常對照組的2.73倍。 2.重組質粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉染對人腎小管上皮細胞脂質代謝的影響 重組質粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉染48小時后總FoxO1蛋白明顯上調，分別是空白對照組和空質粒對照組的1.69倍和1.67倍；重組質粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉染組細胞在高糖刺激下，p-FoxO1蛋白出現(xiàn)明顯上調，經(jīng)內參校對條帶的積分光密度比為0.77±0.09，分別是空白對照組和空質粒對照組的1.91倍和2.00倍；高糖刺激下，pcDNA3.1-wt FoxO1質粒轉染組ADRP表達量也明顯升高，分別是空白對照組和空質粒對照組的1.56倍和1.57倍。Real-time PCR檢測FAS mRNA表達，發(fā)現(xiàn)在pcDNA3.1-wt FoxO1重組質粒轉染組細胞中，F(xiàn)AS mRNA表達量較對照組明顯升高。采用油紅O染色方法檢測細胞內脂滴形成情況，pcDNA3.1-wt FoxO1重組質粒轉染組較空白對照組出現(xiàn)更為清晰的紅染脂滴顆粒。 3．pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）重組質粒轉染人腎小管上皮細胞的表達和影響 Western blot檢測顯示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）質粒轉染48小時后總FoxO1蛋白較空白對照組明顯升高，定量分析為1.05±0.31；p-FoxO1蛋白定量分析為0.34±0.03，與空白對照組相比減少17.4％；ADRP表達量也明顯降低，條帶積分光密度比值為0.73±0.14，與空白對照組相比降低31.8％。Real-time PCR結果顯示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）質粒轉染組細胞FAS mRNA表達下降，較空白對照組減少了36.5%。油紅O染色方法顯示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）重組質粒轉染組細胞內紅染脂滴顆粒與空白對照組相比數(shù)量減少。 結論： 1.高糖刺激下人腎小管上皮細胞磷酸化FoxO1蛋白表達上調，F(xiàn)ASmRNA和ADRP蛋白表達增加并引起細胞內脂滴形成增多，提示磷酸化FoxO1可能參與了糖尿病腎小管上皮細胞的脂質沉積。 2. pcDNA3.1-wt FoxO1重組質粒在高糖刺激下能夠促進體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞p-FoxO1表達，上調脂肪酸合成酶并引起細胞脂質合成增多。 3. pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）質粒轉染的HK2細胞在高糖刺激下，細胞內脂質合成并未升高，避免了野生型FoxO1質粒引起的脂質合成增多，提示FoxO1磷酸位點Ser256發(fā)生突變，高糖刺激下FoxO1不能被磷酸化形成p-FoxO1，可能抑制了高糖刺激下腎小管上皮細胞的脂質合成。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692
【目錄】：

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本文編號：153924