本文關鍵詞：脂聯素通過抑制NLRP3炎癥小體激活減輕糖尿病血管內皮損傷　出處：《第四軍醫(yī)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景:糖尿病血管并發(fā)癥是導致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者傷殘和死亡的最主要原因。內皮功能障礙是造成糖尿病血管病變的始動因素以及早期病理表現,并能夠顯著促進血管損傷的發(fā)展。盡管糖尿病內皮損傷的具體機制尚不完全清楚,但大量研究表明:高糖高脂狀態(tài)、慢性炎癥反應、氧化硝化應激等可能是糖尿病內皮損傷的可能機制。NLRP3炎癥小體可以被鉀離子通道開放、尿酸、活性氧族等激活,調節(jié)半胱天冬酶-1(Caspase-1)的活化進而促進細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟,在胰島素抵抗和糖尿病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們實驗室的前期研究發(fā)現,心肌微血管內皮細胞NLRP3炎癥小體的激活參與了心肌缺血再灌注損傷,那么NLRP3炎癥小體是否在糖尿病血管損傷中發(fā)揮了作用仍未可知。脂聯素是脂肪細胞分泌的血漿蛋白,具有減輕心肌缺血再灌注損傷和改善糖尿病胰島素抵抗的作用。大量流行病學研究表明,肥胖和糖尿病狀態(tài)下,機體脂聯素水平降低與心血管疾病風險增高密切相關。此外,很多臨床和基礎研究證明:低脂聯素血癥與內皮依賴的血管舒張功能降低緊密相關。脂聯素具有抗炎和血管保護作用,但其具體的分子機制還有待進一步研究。本研究擬通過在體及離體實驗探討NLRP3炎癥小體是否參與了糖尿病血管損傷;血漿脂聯素水平減低是否介導了NLRP3炎癥小體激活;脂聯素是否通過抑制NLRP3炎癥小體激活減輕糖尿病血管損傷及具體機制的研究。研究目的:1.闡明NLRP3炎癥小體在糖尿病血管內皮損傷中的作用;2.闡明脂聯素通過抑制NLRP3炎癥小體激活發(fā)揮血管內皮保護作用;3.闡明脂聯素抑制NLRP3炎癥小體激活的具體機制。研究方法:第一部分:NLRP3炎癥小體激活引起糖尿病血管內皮功能障礙1.采用高脂飼料喂養(yǎng)8周的方法構建2型糖尿病小鼠模型,采用NLRP3炎癥小體特異性抑制劑MCC950(1μg/m L)分別孵育普通小鼠和糖尿病小鼠主動脈段。高糖(25mmol/L葡萄糖)、高脂(0.5 mmol/L軟脂酸鈉)處理內皮細胞,模擬體內糖尿病的高糖高脂狀態(tài);2.Western blot NLRP3炎癥小體表達及其下游分子Caspase-1的激活水平,Elisa法檢測Caspase-1切割成熟的IL-1β和IL-18水平;3.多通道血管張力測定儀檢測小鼠主動脈血管舒張情況;4.高糖高脂孵育內皮細胞,Western blot和Elisa法檢測NLRP3炎癥小體激活水平;5.采用NLRP3炎癥小體特異性si RNA處理細胞,檢測內皮細胞凋亡和內皮細胞炎癥反應,內皮細胞舒張功能;第二部分:脂聯素通過抑制NLRP3炎癥小體激活減輕糖尿病血管內皮損傷及其機制研究采用高脂飼料喂養(yǎng)8周的方法構建2型糖尿病小鼠模型,1400W(2mg/kg,選擇性i NOS抑制劑)或EUK134(5 mg/kg,硝基酪氨酸清除劑)腹腔注射4周。1.多通道血管張力測定系統(tǒng)檢測主動脈血管舒張情況,Western blot檢測凋亡情況,Elisa法檢測血管炎癥反應;2.Western blot和Elisa法檢測NLRP3炎癥小體激活水平;3.高糖高脂孵育內皮細胞,Western blot和Elisa法檢測NLRP3炎癥小體激活水平。4.采用脂聯素和NLRP3炎癥小體特異性基因過表達質粒轉染細胞,檢測內皮細胞舒張功能,內皮細胞凋亡和內皮細胞炎癥反應;5.硝基酪氨酸檢測試劑盒檢測血管硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)表達情況。研究結果:1.高脂飼料喂養(yǎng)8周后,小鼠體重顯著增加,葡萄糖耐量變差,脂聯素敲除鼠與野生小鼠相比,葡萄糖耐量更差。2.和正常對照小鼠相比,T2DM小鼠血管NLRP3炎癥小體表達明顯增加,其下游Caspase-1激活明顯增加,炎癥因子IL-1β和IL-18含量明顯增加,內皮依賴的血管舒張功能障礙。采用NLRP3炎癥小體特異性抑制劑MCC950分別孵育正常小鼠和T2DM小鼠主動脈段,發(fā)現其能明顯改善T2DM小鼠內皮依賴的血管舒張功能。4.高糖/高脂培養(yǎng)基導致HUVECs NLRP3炎癥小體激活明顯增加,NLRP3炎癥小體特異性si RNA能夠減輕高糖高脂引起的內皮細胞損傷,具體表現為凋亡減少,內皮功能改善,炎癥反應降低。5.脂聯素敲除鼠誘導成2型糖尿病模型后,與野生小鼠造成的2型糖尿病相比,血管炎癥小體明顯增加,血管損傷加重,具體表現在內皮依賴的血管舒張功能下降,血管炎癥反應增加。給予NLRP3特異性抑制劑MCC950孵育離體血管,發(fā)現兩者內皮依賴的血管舒張功能都恢復到基本相同的水平。6.高糖高脂孵育導致HUVECs NLRP3炎癥小體激活明顯增加,給予脂聯素治療能降低NLRP3炎癥小體激活的水平,并且能減輕內皮細胞損傷,具體表現在凋亡減少,內皮功能改善,炎癥反應減少。7.NLRP3炎癥小體基因過表達質粒轉染HUVECs導致炎癥小體激活明顯增加,給予脂聯素治療能抑制NLRP3炎癥小體激活,改善HUVECs功能,但過表達質粒合并脂聯素處理細胞,發(fā)現脂聯素抑制NLRP3炎癥小體激活的作用消失了,脂聯素對內皮細胞的保護作用也消失了。8.脂聯素有抑制氧化硝化應激的作用。脂聯素敲除鼠誘導成2型糖尿病模型后,血管硝基酪氨酸水平明顯高于糖尿病小鼠,并且其NLRP3炎癥小體的激活水平也明顯高于糖尿病小鼠。給予1400W(選擇性i NOS抑制劑)或EUK134(硝基酪氨酸清除劑)治療后,發(fā)現硝基酪氨酸水平和NLRP3炎癥小體激活水平減低到與糖尿病小鼠基本相同的水平。結論:1.NLRP3炎癥小體激活是引起糖尿病小鼠血管損傷的重要原因。2.脂聯素通過抑制炎癥小體激活NLRP3激活發(fā)揮血管保護作用。3.脂聯素抑制炎癥小體激活的具體機制是通過其抗氧化硝化應激的作用。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2

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本文編號：1332081