本文關鍵詞：中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在SLE中的作用

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【摘要】：研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫病,以抗核抗體產(chǎn)生和免疫復合物聚集為特征。中性粒細胞是機體的第一道免疫防線,數(shù)量多,壽命短。生理情況下,凋亡是主要的中性粒細胞死亡方式。但除了發(fā)生凋亡外,中性粒細胞還可以發(fā)生NETosis。NETosis是在2004年首次被發(fā)現(xiàn)的一種中性粒細胞不同于凋亡和壞死的死亡形式。中性粒細胞發(fā)生NETosis時產(chǎn)生NETs(neutrophil extracellular traps,中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)),NETs是由DNA、組蛋白、抗菌肽及彈性蛋白酶等形成的網(wǎng)狀結構。有研究表明,NETs產(chǎn)生過程中因核物質以及蛋白質暴露在細胞表面,可能成為自身抗原,引起自身抗體的產(chǎn)生,形成免疫復合物,并且刺激某些炎性細胞因子的分泌,因而NETs可能與SLE的發(fā)病機制密切相關。目的:分析SLE患者是否存在NETs水平異常,以及SLE患者血漿內環(huán)境對NETs形成的影響,并分析NETs與SLE臨床指標的相關性及NETs在SLE致炎細胞因子分泌中的作用,從而明確NETs在SLE病理過程中的可能作用。方法:1.收集44例女性SLE患者空腹外周靜脈血,肝素抗凝,無菌分離中性粒細胞(polymorphonuclear leucocyte,PMN),血漿凍存于-80℃?zhèn)溆?同時收集SLE患者的臨床資料。以42例年齡性別相匹配的健康體檢者作為健康對照(healthy control,HC)組。2.nets檢測:一部分pmn用熒光光度法定量測定nets形成率,分析nets在sle患者組和對照組之間是否有差異,并分析nets水平與esr、crp、抗dsdna抗體、抗組蛋白抗體、抗核小體抗體和sledai評分等臨床指標的相關性。另一部分pmn用細胞間接免疫熒光法檢測nets組分之一的中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophilelastase,ne),同時用dapi標記細胞核,利用激光共聚焦顯微鏡觀察nets的形態(tài)結構。3.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)測定血漿中ne的濃度,分析其在sle組和hc組之間是否存在差異,以及ne濃度與esr、crp、抗dsdna抗體、抗組蛋白抗體、抗核小體抗體和sledai評分等臨床指標的相關性。4.收集30例活動期sle及健康對照者的血漿分別制備成混合血漿,處理33例健康者的外周血白細胞24h后,收集培養(yǎng)上清和細胞。培養(yǎng)上清用于檢測il-17、il-6和ifn-α濃度,采用熒光光度法檢測pmn的nets形成率。分析兩組之間的差異。5.用濃度分別為0、12.5、25和50nm的佛波酯刺激健康者的pmn(產(chǎn)生的nets隨佛波酯濃度增加而增加),分別用以刺激外周血單個核細胞24、48h,收集培養(yǎng)上清檢測il-17、il-6和ifn-α濃度,分析nets在不同水平和不同處理時間對外周血單個核細胞分泌il-17、il-6和ifn-α等細胞因子的影響。結果:1.女性sle患者組與健康對照組比較,nets熒光強度為[(240.82±139.20)vs(172.57±134.61),p=0.002],sle組nets水平顯著增高。2.sle患者nets水平與sledai呈正相關(r=0.402,p=0.020),與crp(r=0.122,p=0.504)、esr(r=0.291,p=0.101)、抗dsdna抗體(r=-0.065,p=0.675)、抗組蛋白抗體(r=0.034,p=0.827)、抗核小體抗體(r=-0.268,p=0.078)均無明顯相關性。3.sle組與健康對照組比較,血漿中ne濃度為[(102.02±47.02)vs(61.76±22.25),p=0.000],sle組ne水平顯著高于對照組。4.sle患者血漿中ne水平與sledai呈正相關(r=0.341,p=0.032),與crp(r=-0.437,p=0.07)、esr(r=-0.021,p=0.926)、抗dsdna抗體(r=0.177,p=0.409)、抗組蛋白抗體(r=-0.291,p=0.167)、抗核小體抗體(r=0.202,p=0.343)無明顯相關性。5.外周血白細胞經(jīng)sle混合血漿和健康對照混合血漿培養(yǎng)24h后,(1)兩組間nets熒光強度比較:[(88.06±47.01)vs(63.89±50.49),p=0.000],有顯著差異。結果表明,經(jīng)sle混合血漿處理的pmn,其nets水平增加。(2)兩組間致炎細胞因子濃度比較:il-17濃度為[5.77(2.42,12.11)pg/mlvs2.99(1.82,3.87)pg/ml,p=0.002)],il-6濃度為[606.69(233.64,916.76)pg/mlvs93.71(13.09,181.54)pg/ml,p=0.000],ifn-α濃度為[(98.32±53.13)pg/mlvs(10.92±10.11)pg/ml,p=0.000],均有顯著差異。結果表明,外周血白細胞經(jīng)sle混合血漿處理后,培養(yǎng)上清中致炎細胞因子il-17、il-6和ifn-α的濃度顯著高于健康對照混合血漿處理組。6.經(jīng)不同水平的nets刺激外周血單個核細胞24、48h后,致炎細胞因子il-6和ifn-α濃度顯著高于未處理組,但il-17濃度增高趨勢不明顯,且隨著處理時間的延長,這些細胞因子濃度增高。結論:1.女性SLE患者組NETs水平顯著高于健康對照組,表明SLE患者有NETs形成增強,推測NETs可能參與SLE的病理過程。2.SLE患者NETs水平與SLE疾病活動度評分正相關,表明NETs可能作為SLE嚴重程度的評價指標。但我們的結果未發(fā)現(xiàn)NETs與機體自身抗體的形成有關。3.SLE血漿可促進中性粒細胞形成NETs,效應分子可能包含血漿中IL-17、IL-6和IFN-α等致炎細胞因子。4.佛波酯處理PMN形成的NETs,可以刺激IL-6和IFN-α增高,表明NETs可能是導致SLE炎性病變的原因之一。
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.241;R446

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