本文關(guān)鍵詞：脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

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【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病最常見的的并發(fā)癥,其發(fā)病率和致死率逐漸增加,并成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。腎小球的病理改變首先是基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)增加,隨之系膜細(xì)胞凋亡、腎小球階段性硬化、腎小球?yàn)V過率下降,最終導(dǎo)致腎功能衰竭。系膜細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的增加在DN的進(jìn)程中起著重要作用。高血糖及其代謝產(chǎn)物最初被認(rèn)為是加重糖尿病腎病進(jìn)程的主要因素。但隨著研究的深入,脂質(zhì)在非脂肪細(xì)胞中異位聚集并影響細(xì)胞功能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡即所謂的“脂毒性”進(jìn)入人們的視野。但其導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不完全清楚。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,FABP4,ap2),是脂肪酸結(jié)合蛋白家族中最具特征性的成員,參與游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)和其他親脂性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),在調(diào)節(jié)炎癥、胰島素抵抗、代謝性疾病中起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是脂質(zhì)合成、Ca~(2+)儲(chǔ)存和蛋白質(zhì)折疊與成熟的重要場(chǎng)所。它參與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)一旦被打亂,就會(huì)導(dǎo)致非折疊蛋白的聚集以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum strss,ERS)或未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),持續(xù)的ERS最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是感受與脂質(zhì)代謝相關(guān)應(yīng)激的重要靶細(xì)胞器,高濃度FFAs通過ERS可以引起包括胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡,即“脂性凋亡”,但分子機(jī)制尚不清楚。我們的前期試驗(yàn)已首次證實(shí)人腎小球系膜細(xì)胞正常時(shí)可表達(dá)FABP4,高糖和高FFAs可誘導(dǎo)其FABP4表達(dá)上調(diào)、發(fā)生ERS,細(xì)胞凋亡增加。由此推測(cè)FABP4參與FFAs誘導(dǎo)ERS及ERS相關(guān)凋亡通路。據(jù)此,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,在細(xì)胞學(xué)水平擬通過抑制FABP4表達(dá),觀察高糖和高FFAs誘導(dǎo)的ERS及ERS相關(guān)凋亡通路的變化,探討FABP4的作用。實(shí)驗(yàn)分為兩部分:1 RNA干擾技術(shù)敲低人腎系膜細(xì)胞(Human Mesangial Cell,HMC)的FABP4,比較敲低前后高糖和FFA誘導(dǎo)的ERS及ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化,探究FABP4、FFA、ERS在細(xì)胞凋亡中的作用;2 PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮干預(yù)HMC,在蛋白和mRNA水平比較干預(yù)前后高糖和FFA誘導(dǎo)FABP4、ERS及ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)表達(dá)變化,進(jìn)一步明確FABP4、FFA、ERS在細(xì)胞凋亡中的上下游關(guān)系。方法:1 RNA干擾技術(shù)敲低HMC的FABP4,比較敲低前后高糖和FFA誘導(dǎo)的ERS及ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化(1)實(shí)驗(yàn)分組:HMC細(xì)胞隨機(jī)分為高糖(HG)、高油酸(OA)、高棕櫚酸(PA)三種刺激組。每種刺激組均對(duì)應(yīng)正常對(duì)照組(Control,Ctrl)、空質(zhì)粒組(nontargeting control,NCsi)、質(zhì)粒敲低組(FABP4 si RNA,FABP4si)、刺激加質(zhì)粒敲低組(Stimuli+FABP4 si RNA)、刺激組(Stimuli)五組。(2)應(yīng)用Western Blot以及Real-Time PCR觀察HG、OA和PA刺激對(duì)HMC FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)變化。(3)用RNA干擾技術(shù)敲低FABP4,觀察敲低前后三種刺激對(duì)HMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)變化。2 PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮干預(yù)HMC,在蛋白和mRNA水平比較干預(yù)前后高糖和FFA誘導(dǎo)FABP4、ERS及ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)表達(dá)變化(1)實(shí)驗(yàn)分組:HMC細(xì)胞隨機(jī)分為高糖(HG)、高油酸(OA)、高棕櫚酸(PA)三種刺激組。每種刺激組均對(duì)應(yīng)正常對(duì)照組(Control,Ctrl)、0.5%DMSO組、刺激加吡格列酮干預(yù)組(Stimuli+Pi)、刺激組(Stimuli)四組。(2)應(yīng)用Western Blot以及Real-Time PCR檢測(cè)HG、OA和PA刺激對(duì)HMC FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)變化。(3)用吡格列酮進(jìn)行干預(yù),觀察干預(yù)前后三種刺激對(duì)HMC的FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果:1第一部分(1)HG、OA和PA刺激對(duì)HMC FABP4蛋白和mRNA表達(dá)的影響:三種刺激明顯上調(diào)HMC FABP4蛋白和mRNA的表達(dá);(2)HG、OA和PA刺激對(duì)ERS和ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)的影響:三種刺激在蛋白水平顯著上調(diào)GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6和CHOP、Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase12的表達(dá),在mRNA水平明顯上調(diào)GRP78、IRE1a、PERK、ATF6和CHOP;(3)RNA干擾技術(shù)對(duì)HMC中FABP4表達(dá)量的影響:FABP4si組FABP4蛋白表達(dá)量顯著低于Control組;(4)用RNA干擾技術(shù)敲低FABP4,觀察敲低前后三種刺激對(duì)HMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)變化:與單純刺激組相比,FABP4敲低后HG、OA和PA刺激導(dǎo)致的GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6 ERS相關(guān)蛋白以及CHOP、Cleaved Caspase3、Caspase12凋亡相關(guān)蛋白蛋白表達(dá)量以及HG、OA和PA刺激導(dǎo)致的GRP78、IRE1a、PERK、ATF6 ERS相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白CHOP的mRNA水平顯著下降;(5)空質(zhì)粒對(duì)HMC FABP4、ERS和ERS相關(guān)凋亡指標(biāo)的影響:空質(zhì)粒組HMC FABP4、ERS和ERS相關(guān)凋亡相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2第二部分(1)用吡格列酮進(jìn)行干預(yù),觀察干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對(duì)HMC的FABP4蛋白和mRNA表達(dá)的影響:吡格列酮明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC FABP4蛋白和mRNA的表達(dá),但吡格列酮干預(yù)前后PA刺激組FABP4表達(dá)量均高于正常對(duì)照組;(2)觀察吡格列酮干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對(duì)HMC的ERS相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:吡格列酮顯著下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6的表達(dá),同時(shí)也明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的CHOP、Cleaved Caspase3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);但吡格列酮干預(yù)不能下調(diào)PA刺激組GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6和CHOP、Cleaved Caspase3的高表達(dá);(3)觀察吡格列酮干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對(duì)HMC的ERS相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響:吡格列酮明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC ERS相關(guān)基因GRP78、IRE1a、PERK、ATF6的表達(dá),同時(shí)明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的CHOP細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá);但吡格列酮干預(yù)不能下調(diào)PA刺激的GRP78、IRE1a、PERK、ATF6和CHOP mRNA的高表達(dá)。結(jié)論:1 HG、OA和PA可以在蛋白和mRNA水平上調(diào)人系膜細(xì)胞中的FABP4和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡指標(biāo)水平。證明FFA和高糖可以誘導(dǎo)FABP4表達(dá),激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)凋亡途徑。2 抑制FABP4表達(dá)可以在蛋白和mRNA水平下調(diào)HG、OA和PA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及凋亡相關(guān)指標(biāo)的高表達(dá)。證明FABP4介導(dǎo)高糖和FFA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,FABP4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上游。3 PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮可以下調(diào)OA、HG干預(yù)FABP4高表達(dá),進(jìn)而減輕OA、HG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡。吡格列酮無法下調(diào)PA干預(yù)的FABP4的表達(dá),因而也不能緩解PA干預(yù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡。進(jìn)一步證明OA和高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑是通過FABP4來完成。但PPAR-γ和FABP4與飽和脂肪酸之間的關(guān)系尚需深入研究。
【關(guān)鍵詞】：脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 游離脂肪酸 人腎小球系膜細(xì)胞 吡格列酮
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 第一部分 FABP4在游離脂肪酸介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中的作用14-45
• 前言14-16
• 材料與方法16-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-37
• 討論37-39
• 小結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 第二部分 吡格列酮通過FABP4抑制高糖/高脂誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡45-72
• 前言45-47
• 材料與方法47-56
• 結(jié)果56-58
• 附圖58-66
• 討論66-68
• 小結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 結(jié)論72-73
• 綜述 RNA干擾技術(shù)-MicroRNA73-87
• 參考文獻(xiàn)80-87
• 致謝87-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 張茜;肖新華;;microRNA與糖尿病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系[J];中國(guó)糖尿病雜志;2014年06期

2 夏元平;王立花;樊燕蓉;;細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制[J];藥學(xué)與臨床研究;2010年03期

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本文編號(hào)：792449