發(fā)布時間：2017-08-19 12:28

  本文關(guān)鍵詞：聯(lián)合嗅鞘細胞及GDNF的生物可降解膜系統(tǒng)的性質(zhì)研究

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【摘要】：神經(jīng)修復在臨床上一直是一個困擾著臨床醫(yī)生的難題,近年來隨著科學的進步,在損傷神經(jīng)修復方面獲得了可喜的進步。而目前前列腺癌的發(fā)病率逐年上升,其治療的金標準是采用根治手術(shù)切除前列腺,而手術(shù)過程中會因為鉗夾、燒灼、牽拉等原因不可避免的造成海綿體神經(jīng)的損傷。更為特殊的是,海綿體神經(jīng)擁有著獨特的網(wǎng)狀神經(jīng)結(jié)構(gòu),目前仍沒有理想的方式來進行受損海綿體神經(jīng)的修復。針對海綿體神經(jīng)的特殊解剖學結(jié)構(gòu),我們擬采用膜狀結(jié)構(gòu)全面覆蓋在受損的海綿體神經(jīng)段上,以起到支撐、保護和引導海綿體神經(jīng)再生的作用。靜電紡絲技術(shù)是目前支架結(jié)構(gòu)的新興技術(shù),應用該技術(shù)制造的納米纖維支架具有較大的比表面積和較高的孔隙率,不但有利于生長因子、酶等生物大分子的吸附,還有利于細胞的附著和鋪展,同時有利于細胞和微環(huán)境之間進行物質(zhì)交換。聚乳酸—乙醇酸聚合物[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid),PLGA]具有良好的生物相容性和可降解性,運用靜電紡絲技術(shù)和PLGA材料可以制作出理想的細胞支架。嗅鞘細胞(Olfactory Ensheathing cells,OECs)是來源于嗅上皮基底膜的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,其分布區(qū)域位于嗅神經(jīng)和嗅球,可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)細胞粘附因子,起到幫助損傷神經(jīng)元存活、促進軸突再生和髓鞘化的作用,在神經(jīng)再生中扮演著重要的角色。GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)是最有效的體外支持運動神經(jīng)元生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有保護損傷神經(jīng)、減少神經(jīng)元死亡、促進神經(jīng)纖維再生和幫助運動功能重建的功效。在第一部分,我們采用了改良的Nash法培養(yǎng)了高純度的OECs,免疫熒光鑒定了其純度。在第二部分,我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細胞獲得了高表達GDNF的嗅鞘細胞,并用GFP熒光表達、蛋白印跡和PCR法加以證實。第三部分,我們將高表達GDNF的OECs種于電紡PLGA膜上,從體內(nèi)及體外實驗共同驗證了其生物相容性。最終我們得到了聯(lián)合嗅鞘細胞及GDNF的電紡PLGA可降解膜系統(tǒng),這是一個理想的生物工程學神經(jīng)移植物。第一部分嗅球源OECs分離、培養(yǎng)及鑒定目的從大鼠嗅球取材原代嗅鞘細胞,光鏡下觀察細胞狀態(tài)和增殖情況,運用免疫熒光技術(shù)鑒定嗅鞘細胞純度。方法采用改良的Nash法從120g大鼠嗅球中取材嗅鞘細胞,運用包含b FGF、Forskolin和20%FBS的DEME/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)嗅鞘細胞,在光鏡下觀察細胞狀態(tài)和增殖情況,使用p75NGFR免疫熒光染色鑒定嗅鞘細胞純度。結(jié)果采用改良的nash法,我們成功的獲得了活性高、狀態(tài)好、增殖能力強的嗅鞘細胞,體外最長培養(yǎng)時間可長達30天,但是細胞活性狀態(tài)較好的天數(shù)為14天內(nèi)。p75NGFR免疫熒光顯示嗅鞘細胞純度在95%以上。結(jié)論采用改良的nash法可以獲得高純度的原代嗅鞘細胞,但是嗅鞘細胞是成熟的體細胞,不具有無限增殖的特性,在體外雖然可以大量增殖,但是存活時間有限,需要在30天內(nèi)進行相關(guān)實驗,超過30天后細胞活性差且細胞大量死亡,最佳天數(shù)是在14天以內(nèi)進行相關(guān)實驗。第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染獲得高表達GDNF的嗅鞘細胞及鑒定目的獲得高表達GDNF的嗅鞘細胞,并鑒定其能否高表達GDNF。以聯(lián)合GDNF和嗅鞘細胞共同用于神經(jīng)修復。方法運用含有GDNF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細胞,在熒光下觀察細胞GFP熒光表達情況確定病毒轉(zhuǎn)染率,應用PCR驗證GDNF基因過表達情況,應用蛋白印跡驗證GDNF蛋白生成情況。結(jié)果熒光下觀察到細胞GFP表達在MOL為50:1的情況下為50%,表明病毒轉(zhuǎn)染率為50%。同時PCR驗證GDNF基因過表達情況為對照組正常細胞的130倍。蛋白印跡分析顯示高表達GDNF的嗅鞘細胞能產(chǎn)生GDNF蛋白,而正常的嗅鞘細胞蛋白印跡結(jié)果為陰性。結(jié)論通過慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細胞可以獲得高表達GDNF的嗅鞘細胞,其細胞狀態(tài)好,增殖活性強,能夠用于細胞移植來修復神經(jīng)。第三部分電紡PLGA膜與嗅鞘細胞生物相容性研究目的探索大鼠嗅鞘細胞和靜電紡絲制作的PLGA膜的生物相容性。方法體外培養(yǎng)純化成年大鼠嗅鞘細胞,接種于靜電紡絲PLGA膜上,使用相差顯微鏡觀察和細胞免疫熒光技術(shù)評估細胞在PLGA膜上的粘附和生長情況;將靜電紡絲PLGA膜植入大鼠體內(nèi)觀察其在體內(nèi)的組織相容性。結(jié)果相差顯微鏡顯示嗅鞘細胞能在靜電紡絲PLGA膜上粘附和存活;細胞計數(shù)分析表明細胞增殖正常;電鏡下嗅鞘細胞生長狀態(tài)好;體內(nèi)移植實驗證實靜電紡絲PLGA膜與周圍組織融合并部分降解。結(jié)論嗅鞘細胞在靜電紡絲PLGA膜上良好生長,體內(nèi)移植后組織相容性好,是進行神經(jīng)修復很有潛力的組織工程化神經(jīng)移植物。
【關(guān)鍵詞】：嗅鞘細胞 GDNF PLGA 靜電紡絲
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 原代OECs分離、培養(yǎng)及鑒定15-25
• 一、材料與方法15-19
• 二、結(jié)果19-21
• 三、討論21-22
• 參考文獻22-25
• 第二部分 慢病毒轉(zhuǎn)染獲得高表達GDNF的嗅鞘細胞及鑒定25-37
• 一、材料與方法25-31
• 二、結(jié)果31-33
• 三、討論33-35
• 參考文獻35-37
• 第三部分 電紡PLGA膜與嗅鞘細胞生物相容性研究37-49
• 一、材料與方法37-41
• 二、結(jié)果41-44
• 三、討論44-46
• 參考文獻46-49
• 總結(jié)49-50
• 綜述50-60
• 參考文獻55-60
• 在讀碩士期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明60-61
• 致謝61

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