本文關鍵詞：雙酚A對雄性小鼠生殖和睪丸GPER表達的影響及與腎虛不育的相關性研究

  更多相關文章： BPA 腎虛 行為學 精液質(zhì)量 GPER 相關性

【摘要】：隨著工業(yè)化進程的加劇,大量環(huán)境雌激素(Environmental estrogens,EEs)的釋放造成雄性生精功能障礙,因尚無行之有效防治方法,已引起國內(nèi)外生態(tài)學家及毒理學家的極大關注[1]。雙酚A(Bisphenol-A,BPA)作為一類典型的EEs,是對男性生殖健康危害極大的一類環(huán)境污染物。由于BPA導致的雄性生殖障礙與腎虛不育不僅均出現(xiàn)精子生成的異常,還出現(xiàn)了相關的行為學改變,同時,補腎藥物能夠拮抗BPA引起的雄性生殖障礙的作用。我們的研究也表明[2],腎陽虛不育大鼠不僅出現(xiàn)了精液質(zhì)量降低,還出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、反應遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛枯疏無光等改變,經(jīng)灌服金匱腎氣丸后,上述表現(xiàn)均有所改善。依據(jù)中醫(yī)“腎主生殖”與“方證相應”的理論,我們推測BPA引起的雄性生殖障礙可能屬于腎虛不育的范疇。由于觀察動物高架十字迷宮、曠場實驗、游泳力竭時間等行為學改變,可反映其活動量、驚恐狀態(tài)及耐力表現(xiàn);且雄性動物精液質(zhì)量及育仔數(shù)是判斷動物生育能力的最直觀指標;另外,睪酮(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2)和T/E2水平異常與雄性不育關系密切[3];同時,G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein coupled estrogen receptor,GPER)既能夠通過雌激素介導快速非基因組效應,也能夠間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)控雄性生殖細胞增殖與分化[4]。因此,我們將從行為學、雌雄激素水平及睪丸GPER蛋白表達等方面,對BPA致雄性生殖障礙作用機制與腎虛不育的相關性進行比較,以探討B(tài)PA導致的生殖障礙是否屬于腎虛不育的范疇,不僅可為防治BPA導致的雄性生殖障礙,而且可為男性不育的治療提供新的思路與策略。第一部分:BPA與腎虛致生殖障礙小鼠的行為學改變目的:觀察實驗小鼠行為學改變,探討B(tài)PA致雄性生殖障礙與腎虛不育的相關性。方法:1)將小鼠置于代謝籠中,監(jiān)測小鼠每日體重、睪丸重量、飲水量和尿量變化。2)采用高架十字迷宮裝置,通過計算機數(shù)字化采樣和分析技術(shù)檢測各組小鼠開臂進入次數(shù)所占總進入長臂的百分比以及開臂滯留時間所占總測試時間的百分比,評價小鼠驚恐和焦慮程度,以判斷其活動度與驚恐程度。3)采用曠場實驗儀器,通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),自動分析小鼠活動度,檢測小鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時間百分比,評價小鼠活動和焦慮程度,以判斷其活動度與驚恐程度。4)將小鼠置于長、寬為65cm×50cm長方形水池中,水深50cm,采用負重游泳方式,于小鼠尾根部下3 cm處固定相當于小鼠5%體質(zhì)量的鉛絲,使其自行游泳,以淹沒入水中5 s并且連續(xù)3次者為游泳力竭表現(xiàn),記錄各組小鼠力竭時間,評價小鼠的耐力。結(jié)果:1)與正常組相比,BPA組小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P0.05),睪丸重量亦明顯減輕(P0.01)。與BPA組相比,腎陽虛組小鼠體質(zhì)量無明顯變化(P0.05),睪丸重量雖有增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);腎陰虛組小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P0.01),睪丸重量變化無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2)與正常組相比,BPA組與腎陽虛組小鼠飲水量于造模第5天開始,呈下降趨勢(P0.05),兩組小鼠尿量從第6天開始均顯著增加(P0.05),兩組之間無顯著性差異(P0.05)。與BPA組比較,腎陰虛組小鼠于造模第3天開始飲水量明顯增多(P0.05),尿量則無顯著性差異(P0.05)。3)與正常組相比,BPA組小鼠開臂進入次數(shù)和滯留時間百分比明顯減少(P0.01);與BPA組相比,腎陽虛組小鼠開臂進入次數(shù)和滯留時間百分比無明顯變化(P0.05),腎陰虛組小鼠開臂進入次數(shù)百分比明顯增加(P0.01),而開臂滯留時間百分比無明顯變化(P0.05)。4)與正常組相比,BPA組小鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)減少(P0.05),中央?yún)^(qū)滯留時間百分比亦明顯減少(P0.01)。與BPA組相比,腎陽虛組小鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)顯著減少(P0.05),中央?yún)^(qū)滯留時間百分比無明顯變化(P0.05);腎陰虛組小鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)明顯減少(P0.01),中央?yún)^(qū)滯留時間百分比顯著增加(P0.05)。5)與正常組相比,BPA組小鼠游泳力竭時間明顯縮短(P0.01)。與BPA組相比,腎陽虛組小鼠游泳力竭時間變化無統(tǒng)計學意義(P0.05);而腎陰虛組小鼠游泳力竭時間顯著增加(P0.05)。6)與正常組相比,BPA組和腎陽虛組小鼠均出現(xiàn)了更為明顯的畏寒、蜷縮,毛發(fā)干枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落的現(xiàn)象,從水中撈出到毛發(fā)完全變干的時間也明顯延長,而腎陰虛組毛發(fā)干枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落,但無明顯畏寒、蜷縮的表現(xiàn)。結(jié)論:BPA組與腎陽虛組小鼠體質(zhì)量、睪丸重量、飲水量及尿量等方面改變相似,而腎陰虛小鼠的體質(zhì)量下降更為顯著,飲水量也增加明顯,但尿量較前兩組減少。BPA組與腎陽虛組小鼠均出現(xiàn)驚恐狀態(tài)、活動度減少及耐力下降,并伴毛發(fā)干枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落等行為學表現(xiàn);而腎陰虛組也出現(xiàn)了驚恐狀態(tài),活動次數(shù)增多,雖耐力也下降,但較BPA組與腎陽虛組增加,并出現(xiàn)毛發(fā)干枯、無光澤、稀疏脫落等,但無明顯畏寒、蜷縮的表現(xiàn)。由此得出,BPA導致雄性小鼠生精障礙模型與腎陽虛不育模型更為相似。第二部分:BPA與腎虛致生殖障礙小鼠精液質(zhì)量和雌雄激素水平的變化目的:檢測小鼠精子數(shù)量、精子活動率和畸形精子百分率及血清T、E2及T/E2,探討B(tài)PA與腎虛誘導生殖障礙小鼠在精液質(zhì)量和雌雄激素水平的相關性。方法:1)采用羅氏化學發(fā)光法檢測血清T、E2、并計算T/E2的比值。2)3)將輸精管內(nèi)精液擠出,并將附睪尾剪碎,加入3ml生理鹽水,游離精子,制成精子懸液,在37℃水浴中孵育,使其充分液化。將精子懸液置于全自動精子分析儀(SQAV)進行分析,檢測精子計數(shù)、精子百分率、精子畸形率。將各組雄性小鼠與發(fā)情期成年雌性小鼠同籠,雌雄比例為3:1,觀察檢測同雄鼠育仔數(shù)。結(jié)果:1)與正常組相比,BPA組小鼠血清T和T/E2比值明顯降低(P0.01),E2變化無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與BPA組比較,腎陽虛組小鼠血清T變化無統(tǒng)計學意義(P0.05),E2略有降低,但無統(tǒng)計學意義(P0.05),T/E2比值升高,(P0.05);腎陰虛組小鼠血清T明顯升高(P0.01),E2及T/E2比值均升高(P0.05)。2)與正常組相比,BPA組小鼠精子計數(shù)、活動精子百分率明顯降低,而精子畸形百分率增加(P0.01)。與BPA組比較,腎陽虛組小鼠精子數(shù)量與精子畸形率變化無統(tǒng)計學意義(P0.05),但活動精子百分率增加(P0.05);腎陰虛組小鼠精子數(shù)量增加明顯(P0.01),活動精子百分率顯著增加(P0.05),精子畸形率降低(P0.05)。3)與正常組相比,BPA組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為3.8只,且其中有4只雌鼠未懷孕(P0.05)。與BPA組相比,腎陽虛組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為4.33只,其中有4只雌鼠未懷孕,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);腎陰虛組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為6.46只,其中有4只雌鼠未懷孕(P0.05)。結(jié)論:BPA組與腎陽虛組小鼠血清T降低,而E2變化不顯,T/E2比值顯著下降;與BPA組相比,腎陰虛組小鼠T、E2及T/E2比值均增加;BPA組與腎陽虛組小鼠精子計數(shù)減少,精子畸形百分率增加,BPA組活動精子百分率明顯低于腎陽虛組小鼠;而腎陰虛組小鼠精子數(shù)量、活動精子百分率及精子畸形率均增加。在育仔數(shù)方面,BPA組與腎陽虛組相近;腎陰虛組則較BPA組增加。由此得出,BPA組與腎陽虛組在血清T、E2和T/E2以及精子計數(shù)和精子畸形百分率具有相關性。第三部分:GPER在BPA與腎虛致生殖障礙小鼠睪丸的表達目的:觀察睪丸GPER表達,探討B(tài)PA與腎虛致生精障礙小鼠發(fā)病機制的相關性。方法:1)采用HE染色法,觀察睪丸結(jié)構(gòu)變化。2)采用免疫組化染色(SABC)法,觀察睪丸GPER的定位及表達。3)采用免疫熒光染色法,觀察睪丸GPER表達,并比較。結(jié)果:1)與正常組相比,BPA組、腎陰虛組和腎陽虛組小鼠睪丸曲細精管均呈不同程度的官腔壁受損、變薄,基膜連續(xù)性受到損壞,且生殖細胞呈雜亂無序排列,間質(zhì)細胞分布不均勻,生精上皮細胞層減少,腔內(nèi)精子數(shù)量減少。2)GPER在小鼠睪丸間質(zhì)細胞有表達,其免疫反應陽性物質(zhì)位于間質(zhì)細胞的胞質(zhì)及胞膜內(nèi),細胞核內(nèi)為陰性,在曲細精管內(nèi)的支持細胞及各級生精細胞均未見表達。3)正常組小鼠睪丸GPER呈陽性表達,熒光較弱,但可清楚可見(+);BPA組GPER呈過高表達,熒光明亮,清晰可見(+++),與正常對照組相比有顯著差異(P0.05);腎陽虛組GPER同樣呈過高表達,熒光明亮,清晰可見(+++),與BPA組相比無顯著性差異(P0.05);腎陰虛組GPER表達下調(diào),熒光較暗,但清晰可見(+),與BPA組相比明顯減弱(P0.05)。陰性對照無熒光表達(-)。結(jié)論:BPA組、腎陽虛組及腎陰虛組小鼠均出現(xiàn)了睪丸組織結(jié)構(gòu)均受損。GPER表達于睪丸間質(zhì)細胞質(zhì)及細胞膜上,腎陽虛組小鼠睪丸GPER表達明顯上調(diào)、清晰可見與BPA組相近,與BPA組相比,腎陰虛組小鼠睪丸GPER雖呈陽性,但表達量明顯下調(diào)。由此得出,BPA與腎陽虛導致的生精障礙小鼠睪丸間質(zhì)細胞GPER表達上調(diào),引起性激素水平紊亂,精子質(zhì)量下降,導致雄性生殖障礙。
【關鍵詞】：BPA 腎虛 行為學 精液質(zhì)量 GPER 相關性
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-19
• 文獻回顧19-30
• 第一部分 BPA與腎虛致生精障礙小鼠行為學改變30-39
• 引言30
• 1 材料30-31
• 2 方法31-33
• 3 結(jié)果33-36
• 4 結(jié)論36
• 5 討論36-39
• 第二部分 BPA與腎虛致生精障礙小鼠的精液質(zhì)量及雌雄激素水平39-45
• 引言39
• 1 材料39-40
• 2 方法40
• 3 結(jié)果40-42
• 4 結(jié)論42
• 5 討論42-45
• 第三部分 GPER在BPA與腎虛致生精障礙小鼠睪丸的表達45-54
• 引言45
• 1 材料45-46
• 2 方法46-47
• 3 結(jié)果47-52
• 4 結(jié)論52
• 5 討論52-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻55-61
• 附錄61-64
• 個人簡歷和研究成果64-65
• 致謝65

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