本文關(guān)鍵詞：CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis, RIF)是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎衰竭(End-Stage Renal Disease, ESRD)的主要病理基礎(chǔ)和共同終末途徑,導(dǎo)致患者預(yù)后不良。但是RIF的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,可能與腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)、腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過(guò)度聚集等有關(guān)。炎癥反應(yīng)是間質(zhì)纖維化的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一,炎癥細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn),可以直接通過(guò)巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Macrophage myofibroblast transition, MMT)過(guò)程促進(jìn)纖維化的發(fā)生,還可以通過(guò)促進(jìn)促炎因子的表達(dá),進(jìn)一步加重炎細(xì)胞浸潤(rùn),增加細(xì)胞外基質(zhì)合成,間接導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。炎癥因子的表達(dá)在纖維化中也有重要作用,可以促進(jìn)單核／巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)和增殖分化,刺激促炎及促纖維化細(xì)胞因子表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和大量積聚,使損傷腎臟的炎癥反應(yīng)加重,加速間質(zhì)纖維化進(jìn)展。EMT主要表現(xiàn)為小管上皮細(xì)胞丟失固有的表型標(biāo)志蛋白,表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞蛋白,出現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣改變,具有較強(qiáng)的侵襲和遷移能力,而且還可以分泌多種細(xì)胞因子,參與炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)生過(guò)程。而TGF-β1在EMT的發(fā)生中起著重要的作用,是參與纖維化過(guò)程的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子,主要通過(guò)Smad信號(hào)蛋白發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β是具有多種功能的細(xì)胞因子,參與多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),包括samd蛋白依賴性和smad蛋白非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。TGF-β可以調(diào)節(jié)多種病理生理過(guò)程,是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,可以抑制大多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng),但是卻可以刺激間葉細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生,導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。與TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)的蛋白主要包括TGF-β1受體調(diào)控信號(hào)蛋白(Smad2, Smad3)、抑制性信號(hào)蛋白(Smad7)和共同作用信號(hào)蛋白(Smad4), TGF-β1與其受體結(jié)合,磷酸化Smad2、Smad3蛋白,與Smad4結(jié)合形成寡聚體復(fù)合物,一起進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程,使細(xì)胞外基質(zhì)積聚,導(dǎo)致腎臟的纖維化。因此,抑制TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以抑制EMT發(fā)生和腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展。有多種蛋白可以參與負(fù)性調(diào)節(jié)EMT過(guò)程。Smad7蛋白分子在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是主要的抑制性蛋白質(zhì),通過(guò)招募E3泛素連接酶,導(dǎo)致TGF-β的I型受體(TβRI)和Smad2, Smad3蛋白的泛素化降解；招募蛋白磷酸酶I(PP1c)到TβRI,使其去磷酸化失活,阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor, HGF)可以特異性上調(diào)Smad2和Smad3蛋白的轉(zhuǎn)錄共抑制子SnoN表達(dá),抑制TGF-β1靶基因的激活,從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT的作用。此外,熱休克蛋白72(HSP72)可以與Smad3及p-Smad3蛋白相互作用,抑制TGF-β誘導(dǎo)的磷酸化和核易位,抑制EMT的發(fā)生。還可以抑制a-SMA、Fibronectin等間質(zhì)蛋白的表達(dá),阻斷STAT3信號(hào)通路的下游信號(hào)分子的表達(dá),抑制STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。HSP72可通過(guò)多種途徑來(lái)抑制腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。還有研究表明,骨形成蛋白-7(BMP-7)是TGF超家族的亞家族成員,也是一種負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白,可以通過(guò)阻斷小管上皮細(xì)胞的凋亡、減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,抑制TGF誘導(dǎo)的EMT和纖維化。CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2 (CUE domain containing protein 2, CUEDC2)是一個(gè)功能尚不明確的新蛋白質(zhì),含有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,廣泛存在于多種真核細(xì)胞中,可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)發(fā)生及腫瘤的發(fā)生。CUEDC2可以識(shí)別單泛素化及多泛素化,促進(jìn)蛋白質(zhì)的泛素化及降解。CUEDC2能與孕激素受體結(jié)合,抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),導(dǎo)致乳腺癌內(nèi)分泌治療的耐藥。CUEDC2在多種腫瘤中有不同表達(dá),如在卵巢癌、腎癌中高表達(dá),在肺癌中低表達(dá),提示在不同的腫瘤組織中CUEDC2蛋白發(fā)揮的作用可能是不同的。此外,CUEDC2可以阻斷NF-κB通路,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。而且NF-κB的活化與UUO的發(fā)病機(jī)制有關(guān),阻斷這條通路,可以抑制UUO的炎癥反應(yīng)。但是,CUEDC2蛋白在腎臟纖維化中的作用尚未有闡述,本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)建立纖維化模型來(lái)探討CUEDC2在腎纖維化中的作用及其可能的機(jī)制。(一) CUEDC2蛋白對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎組織炎癥反應(yīng)的作用目的：研究CUEDC2蛋白在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織炎癥反應(yīng)中的作用。方法：建立單側(cè)輸尿管梗阻模型：清潔級(jí)balb/c小鼠30只(購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham-vector)、UUO組(uuo-vector)、CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組(uuo-cuedc2),每組分別有10只小鼠。UUO組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組均行單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù),即將右側(cè)輸尿管進(jìn)行游離并結(jié)扎離斷,而假手術(shù)組只游離右側(cè)輸尿管,不進(jìn)行結(jié)扎離斷。采用超聲微泡聯(lián)合穿膜肽技術(shù)分別在術(shù)前1天、術(shù)后1天及術(shù)后7天給三組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,假手術(shù)組和UUO組轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒,治療組轉(zhuǎn)染cuedc2質(zhì)粒。質(zhì)粒均經(jīng)由尾靜脈注入。于術(shù)后第7天和第14天分別處死小鼠,每組5只。留取組織標(biāo)本時(shí),采集各組小鼠血液,離心吸取上清,-80℃保存?zhèn)溆�。灌流沖洗,待腎臟變白后小心剝離右側(cè)腎臟,去除包膜,將腎組織分為不同小塊,留做免疫組化或用于提取組織蛋白。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)炎癥因子細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1, intercellular cell adhesion molecule 1)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1, monocyte chemotactic protein 1)、白介素-1(IL-1)、白介素-8(IL-8)表達(dá)：免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織單核／巨噬細(xì)胞表面抗原(CD68)及腎臟組織中CUEDC2蛋白的表達(dá)；結(jié)果：CUEDC2免疫組化結(jié)果顯示,UUO術(shù)后CUEDC2蛋白表達(dá)減少,經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,其表達(dá)增加(p0.05). ELISA及CD68抗原免疫組化結(jié)果顯示,UUO模型組,炎癥因子ICAM1、MCP1、IL1、IL8及CD68抗原表達(dá)增加,隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng),增多趨勢(shì)更加明顯(p0.05)；治療組中炎癥因子表達(dá)和CD68抗原表達(dá)下調(diào),在各時(shí)間點(diǎn)均低于UUO組的表達(dá)。小結(jié)：CUEDC2蛋白可以抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、減少炎癥因子在纖維化腎組織中的表達(dá),減輕腎臟炎癥反應(yīng),進(jìn)而可以抑制腎臟纖維化的發(fā)生。(二) CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及其可能機(jī)制(1)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慍UEDC2蛋白在腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞)EMT中的作用及可能機(jī)制。方法：5ng/ml TGF-p1刺激HK2細(xì)胞,共6個(gè)時(shí)間點(diǎn),誘導(dǎo)其EMT模型形成。用試劑盒提取vector和cuedc2目標(biāo)質(zhì)粒,制備慢病毒,用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目標(biāo)質(zhì)粒的HK2細(xì)胞系,之后同樣用TGF-p1來(lái)刺激細(xì)胞,調(diào)整為刺激4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。Western免疫印跡檢測(cè)CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、 Vimentin、p-smad2、p-smad3和smad2、smad3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：TGF-p1刺激HK2細(xì)胞,使其E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào),Fibronectin蛋白表達(dá)上調(diào),隨刺激時(shí)間延長(zhǎng),這種變化趨勢(shì)愈加明顯,表明TGF-β誘導(dǎo)的EMT模型已經(jīng)成功建立,此時(shí),CUEDC2蛋白隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng),表達(dá)量逐漸下調(diào)。TGF-β1分別刺激過(guò)表達(dá)vector及cuedc2的HK2細(xì)胞,CUEDC2蛋白表達(dá)在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組明顯增加,表明穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。此時(shí),與對(duì)照組相比,CUEDC2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組中,在刺激的各時(shí)間點(diǎn),E-cadherin蛋白表達(dá)增加,Fibronectin、Vimentin蛋白表達(dá)下降,p-smad2和p-smad3蛋白表達(dá)減少。小結(jié)：CUEDC2蛋白在TGF-P誘導(dǎo)的EMT中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)CUEDC2可以減少間質(zhì)表型蛋白表達(dá),增加上皮表型蛋白表達(dá),抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化表達(dá),抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT, CUEDC2可能參與了EMT的負(fù)性調(diào)節(jié)過(guò)程。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慍UEDC2蛋白在梗阻性腎病對(duì)間質(zhì)纖維化的影響及其可能的機(jī)制。方法：UUO模型建立及組織標(biāo)本收集,同上。HE及Masson染色觀察腎臟病理改變,Western Blot用于檢測(cè)腎組織中CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、 p-smad2、p-smad3等蛋白的表達(dá)。結(jié)果：CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組,UUO術(shù)后7d及14d,腎組織的小管變性壞死程度、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化改變程度較UUO組明顯減輕,腎間質(zhì)的藍(lán)染面積與UUO組相比顯著降低。經(jīng)CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療后,CUEDC2蛋白表達(dá)上調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)量增加,Fibronecti、Collagen I、p-smad2、 p-smad3蛋白表達(dá)量降低。小結(jié)：CUEDC2在UUO腎纖維化中,可以減輕腎小管損害程度,減少間質(zhì)膠原的沉積,抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成,抑制p-smad2和p-smad3蛋白的表達(dá),抑制腎間質(zhì)纖維化。結(jié)論：CUEDC2蛋白在細(xì)胞EMT模型和動(dòng)物UUO模型中均表達(dá)下調(diào),是一種負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白；CUEDC2蛋白通過(guò)抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、減少炎癥因子的表達(dá),減弱纖維化的炎癥反應(yīng)；通過(guò)減少間質(zhì)的膠原沉積,抑制腎組織smad2、 smad3蛋白磷酸化,增加smad7蛋白的表達(dá),抑制TGF/smad信號(hào)通路激活,抑制EMT過(guò)程,進(jìn)而減輕腎臟纖維化程度,有一定的腎臟保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：CUEDC2 炎癥因子 間質(zhì)纖維化 上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化TGF-β/s mad信號(hào)通路 單側(cè)輸尿管梗阻
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一部分 CUEDC2對(duì)梗阻性腎病腎組織炎癥反應(yīng)的作用20-37
• 1.1 研究目的20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法20-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 1.4 討論34-37
• 第二部分 CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及可能機(jī)制37-56
• 2.1 研究目的37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法37-44
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-51
• 2.4 討論51-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 綜述61-64
• 致謝64-66

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1 姜Z腪，

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