發(fā)布時間：2017-06-20 14:11

  本文關鍵詞：常染色體顯性遺傳多囊腎病伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者PKD1基因突變的篩查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的顱內(nèi)動脈瘤(intracrartial aneurysm,ICA)系顱內(nèi)動脈血管壁形成的血管瘤樣病變,一旦破裂便引起蛛網(wǎng)膜下腔出血。而且顱內(nèi)動脈瘤破裂導致的死亡率和致殘率非常高,所以ICA威脅著患者的生命健康,也給家庭和社會也帶來了沉重的負擔。顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生存在著許多影響因素,其環(huán)境因素主要包括:高血壓、抽煙、性別、酗酒、年齡、吸毒、季節(jié)等,前三項風險因素最為重要,也很可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用促進了疾病的發(fā)生,但是現(xiàn)在研究顯示,遺傳因素在ICA的發(fā)病中也占據(jù)重要的地位。常染色體顯性遺性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,即:ADPKD)是臨床上最常見的遺傳性疾病之一,ADPKD是單基因遺傳病,其患病率約為1/1000-1/400[1],大約3/5的患者都存在家族性遺傳史。而且此遺傳病的外顯率高,可達95%以上,80歲以上的攜帶者幾乎均顯示出該病的某些征象。ADPKD具有明顯的遺傳延遲性,其發(fā)病一般主要在中年以后,其病理特點主要表現(xiàn)在雙側腎臟上,可形成許多大小不等的液性囊腫,伴隨著囊腫的不斷增大,腎臟結構會遭到破壞,隨之腎臟功能也隨之喪失,最終發(fā)展為尿毒癥,腎臟功能衰竭。通過臨床觀察發(fā)現(xiàn):大約50%的患者,在60歲左右即會發(fā)展到終末期腎臟功能衰竭階段[2],所以目前腎臟功能衰竭是臨床成人多囊腎病最常見的死亡原因之一。ADPKD是一種系統(tǒng)性的遺傳性疾病,它的病變主要累及在雙側腎臟,除此之外還可波及到患者的肝臟、胰腺、脾臟、卵巢及全身心血管等多個系統(tǒng),如發(fā)生在組織器官,可形成肝囊腫、脾囊腫、胰囊腫、卵巢囊腫和精囊囊腫等等;在全身心血管系統(tǒng)中,在冠狀動脈、顱內(nèi)動脈等動脈處均可形成大小不等的動脈瘤,如若動脈瘤發(fā)生在腹股溝處,患者可導致腹股溝疝,如發(fā)生在心臟瓣膜處,可導致心臟瓣膜異常,如瓣膜關閉不全等病變。PKD1、PKD2和PKD3基因是國內(nèi)外已經(jīng)報道的、引起ADPKD三種主要受累基因,而從目前研究發(fā)現(xiàn),PKD1基因是引起ADPKD的最主要致病基因。高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)技術是在國內(nèi)外發(fā)展起的一種新型的遺傳學檢測方法。HRM技術源于熔解曲線,所以它是在實時熒光定量PCR的基礎上,僅僅是增加改進了一種新型的熒光飽和染料,即:它是利用一種綠色的熒光飽和染料不斷監(jiān)控核酸雙鏈變化情況,隨后通過熔解曲線走形而進行分析。HRM技術不受突變堿基種類與位點的局限,具有速度快、操作簡便、成本低,靈敏度和特異性高、準確率高和實現(xiàn)真正的閉管操作等優(yōu)點,從而被迅速而廣泛的應用到基因突變掃描,基因分型與序列匹配,甲基化分析,短片段重復序列與RNA編輯等多方領域中。本研究中采用高分辨率熔解曲線(HRM)分析技術檢測常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)及其伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤(ICA)患者的PKD1基因的突變,從而建立一種簡便而又可靠的篩查、檢測PKD1基因突變的方法,分析突變產(chǎn)生的位置和形式,從而進一步推斷其發(fā)病機制,并探討HRM技術特點,以及其用于臨床ADPKD患者篩查與診斷的可行性。方法收集整理2013年7月到2014年8月上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院收治的ADPKD患者,所有患者均經(jīng)B超、CT、磁共振血管成像法篩選患有顱內(nèi)動脈瘤的患者,共收集ADPKD伴發(fā)ICA患者32例。采集32例患者術前清晨空腹外周血4m L,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,隨后倒入醫(yī)用干紗布上,晾干制成干血痕。常規(guī)酚-氯仿法抽提32例患者的基因組DNA。設計PCR反應和HRM分析所需的引物,對PCR反應條件進行優(yōu)化,并擴增目的基因片段。隨后用HRM法檢測32例ADPKD患者PKD1基因的1到46號外顯子的突變情況,并對HRM結果中,懷疑為突變的基因樣本進行直接測序驗證,從而確定樣本存在的突變類型。結果通過HRM技術對32例ADPKD伴發(fā)ICA患者的46個外顯子的56個片段區(qū)域進行檢測分析,有4對外顯子引物未得到熔解曲線圖,從獲得的熔解曲線峰形圖中可知,有9例(1、7、8、9、10、16、18、20和28號)患者存在28條異常的熔解曲線,9例患者標本經(jīng)測序法得到證實,均存在PKD1基因的突變。本實驗中共檢出62個位點突變,其突變率為28.13%:62個突變均為點突變,其中錯義突變28種,無義突變1種,同義突變12種。62個突變分布于13個外顯子,其中11和15號外顯子突變最多,均為12例,分別占總突變的19.36%;10號外顯子9例突變,占14.52%;13號外顯子8例突變,占12.90%;5和25號外顯子均存在4例突變,分別占6.45%;29號外顯子3例突變,占4.84%;7、16、23和26號外顯子均存在2例突變,分別占3.23%;27和38號外顯子均存在1例突變,分別占1.61%。直接測序法證實兩種方法的檢測結果完全一致。結論用HRM法能快速、靈敏、準確的檢測出ADPKD患者PKD1基因的突變情況,不僅可以檢測出已知的基因突變,而且可以簡便、快捷的篩查出一些未知的突變。經(jīng)分析得出:新興的HRM技術具有操作簡便快速、實驗結果準確、成本低、靈敏度高及其特異性高等優(yōu)點,可作為ADPKD患者及ADPKD家族攜帶者的突變檢測與篩查的優(yōu)選方法,適合在臨床推廣。
【關鍵詞】：高分辨率熔解曲線 常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD) PKD1基因 顱內(nèi)動脈瘤 基因突變
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692;R743
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 中英文縮略詞索引14-16
• 前言16-20
• 1 材料與方法20-27
• 1.1 材料20-22
• 1.2 方法22-27
• 2 結果27-36
• 2.1 血痕提取的DNA純度及濃度檢測結果27
• 2.2 長片段PCR擴增結果27-31
• 2.3 高分辨率熔解曲線檢測結果31
• 2.4 測序結果31-34
• 2.5 統(tǒng)計結果34-36
• 3 討論36-42
• 4 結論42-43
• 附表43-48
• 附圖48-64
• 參考文獻64-67
• 綜述 高分辨率熔解曲線技術及其應用進展67-85
• 1.高分辨率溶解曲線技術的原理與特點68-71
• 1.1 高分辨率溶解曲線技術基本原理68
• 1.2 HRM技術的發(fā)展與特點68-71
• 2.HRM在分子診斷中的應用進展71-78
• 2.1 基因突變掃描(GENE SCREENING)71-73
• 2.2 基因分型（GENOTYPING）73-74
• 2.3 序列匹配（SEQUENCE MATCHING）74-75
• 2.4 甲基化研究（METHYLATION ANALYSIS)75-76
• 2.5 SNP分析（INGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM，SNP）76-78
• 2.6 RNA編輯（RNA EDITING）78
• 3.HRM技術的優(yōu)勢和不足78-80
• 4.展望80-81
• 參考文獻81-85
• 個人簡歷、在研期間發(fā)表論文及獎勵85-86
• 致謝86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張殿勇,張樹忠,湯兵,張維莉,戴兵,盛茂,孫田美,梅長林;利用PCR-SSCP技術檢測中國漢族人PKD2基因的突變[J];第二軍醫(yī)大學學報;2002年04期

2 邵勇;鐘綺麗;張杰;楊虹;萬峻;胡小平;陳辦成;于波;;高分辨率溶解技術定量檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血細胞中CD70啟動子低甲基化水平[J];中華實用診斷與治療雜志;2010年07期

  本文關鍵詞：常染色體顯性遺傳多囊腎病伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者PKD1基因突變的篩查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：465868