本文關(guān)鍵詞：常染色體顯性遺傳多囊腎病伴發(fā)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者PKD1基因突變的篩查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracrartial aneurysm,ICA)系顱內(nèi)動(dòng)脈血管壁形成的血管瘤樣病變,一旦破裂便引起蛛網(wǎng)膜下腔出血。而且顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的死亡率和致殘率非常高,所以ICA威脅著患者的生命健康,也給家庭和社會(huì)也帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生存在著許多影響因素,其環(huán)境因素主要包括:高血壓、抽煙、性別、酗酒、年齡、吸毒、季節(jié)等,前三項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素最為重要,也很可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用促進(jìn)了疾病的發(fā)生,但是現(xiàn)在研究顯示,遺傳因素在ICA的發(fā)病中也占據(jù)重要的地位。常染色體顯性遺性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,即:ADPKD)是臨床上最常見的遺傳性疾病之一,ADPKD是單基因遺傳病,其患病率約為1/1000-1/400[1],大約3/5的患者都存在家族性遺傳史。而且此遺傳病的外顯率高,可達(dá)95%以上,80歲以上的攜帶者幾乎均顯示出該病的某些征象。ADPKD具有明顯的遺傳延遲性,其發(fā)病一般主要在中年以后,其病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)在雙側(cè)腎臟上,可形成許多大小不等的液性囊腫,伴隨著囊腫的不斷增大,腎臟結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞,隨之腎臟功能也隨之喪失,最終發(fā)展為尿毒癥,腎臟功能衰竭。通過臨床觀察發(fā)現(xiàn):大約50%的患者,在60歲左右即會(huì)發(fā)展到終末期腎臟功能衰竭階段[2],所以目前腎臟功能衰竭是臨床成人多囊腎病最常見的死亡原因之一。ADPKD是一種系統(tǒng)性的遺傳性疾病,它的病變主要累及在雙側(cè)腎臟,除此之外還可波及到患者的肝臟、胰腺、脾臟、卵巢及全身心血管等多個(gè)系統(tǒng),如發(fā)生在組織器官,可形成肝囊腫、脾囊腫、胰囊腫、卵巢囊腫和精囊囊腫等等;在全身心血管系統(tǒng)中,在冠狀動(dòng)脈、顱內(nèi)動(dòng)脈等動(dòng)脈處均可形成大小不等的動(dòng)脈瘤,如若動(dòng)脈瘤發(fā)生在腹股溝處,患者可導(dǎo)致腹股溝疝,如發(fā)生在心臟瓣膜處,可導(dǎo)致心臟瓣膜異常,如瓣膜關(guān)閉不全等病變。PKD1、PKD2和PKD3基因是國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的、引起ADPKD三種主要受累基因,而從目前研究發(fā)現(xiàn),PKD1基因是引起ADPKD的最主要致病基因。高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)技術(shù)是在國(guó)內(nèi)外發(fā)展起的一種新型的遺傳學(xué)檢測(cè)方法。HRM技術(shù)源于熔解曲線,所以它是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基礎(chǔ)上,僅僅是增加改進(jìn)了一種新型的熒光飽和染料,即:它是利用一種綠色的熒光飽和染料不斷監(jiān)控核酸雙鏈變化情況,隨后通過熔解曲線走形而進(jìn)行分析。HRM技術(shù)不受突變堿基種類與位點(diǎn)的局限,具有速度快、操作簡(jiǎn)便、成本低,靈敏度和特異性高、準(zhǔn)確率高和實(shí)現(xiàn)真正的閉管操作等優(yōu)點(diǎn),從而被迅速而廣泛的應(yīng)用到基因突變掃描,基因分型與序列匹配,甲基化分析,短片段重復(fù)序列與RNA編輯等多方領(lǐng)域中。本研究中采用高分辨率熔解曲線(HRM)分析技術(shù)檢測(cè)常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)及其伴發(fā)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(ICA)患者的PKD1基因的突變,從而建立一種簡(jiǎn)便而又可靠的篩查、檢測(cè)PKD1基因突變的方法,分析突變產(chǎn)生的位置和形式,從而進(jìn)一步推斷其發(fā)病機(jī)制,并探討HRM技術(shù)特點(diǎn),以及其用于臨床ADPKD患者篩查與診斷的可行性。方法收集整理2013年7月到2014年8月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院收治的ADPKD患者,所有患者均經(jīng)B超、CT、磁共振血管成像法篩選患有顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的患者,共收集ADPKD伴發(fā)ICA患者32例。采集32例患者術(shù)前清晨空腹外周血4m L,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,隨后倒入醫(yī)用干紗布上,晾干制成干血痕。常規(guī)酚-氯仿法抽提32例患者的基因組DNA。設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和HRM分析所需的引物,對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,并擴(kuò)增目的基因片段。隨后用HRM法檢測(cè)32例ADPKD患者PKD1基因的1到46號(hào)外顯子的突變情況,并對(duì)HRM結(jié)果中,懷疑為突變的基因樣本進(jìn)行直接測(cè)序驗(yàn)證,從而確定樣本存在的突變類型。結(jié)果通過HRM技術(shù)對(duì)32例ADPKD伴發(fā)ICA患者的46個(gè)外顯子的56個(gè)片段區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)分析,有4對(duì)外顯子引物未得到熔解曲線圖,從獲得的熔解曲線峰形圖中可知,有9例(1、7、8、9、10、16、18、20和28號(hào))患者存在28條異常的熔解曲線,9例患者標(biāo)本經(jīng)測(cè)序法得到證實(shí),均存在PKD1基因的突變。本實(shí)驗(yàn)中共檢出62個(gè)位點(diǎn)突變,其突變率為28.13%:62個(gè)突變均為點(diǎn)突變,其中錯(cuò)義突變28種,無義突變1種,同義突變12種。62個(gè)突變分布于13個(gè)外顯子,其中11和15號(hào)外顯子突變最多,均為12例,分別占總突變的19.36%;10號(hào)外顯子9例突變,占14.52%;13號(hào)外顯子8例突變,占12.90%;5和25號(hào)外顯子均存在4例突變,分別占6.45%;29號(hào)外顯子3例突變,占4.84%;7、16、23和26號(hào)外顯子均存在2例突變,分別占3.23%;27和38號(hào)外顯子均存在1例突變,分別占1.61%。直接測(cè)序法證實(shí)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致。結(jié)論用HRM法能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)出ADPKD患者PKD1基因的突變情況,不僅可以檢測(cè)出已知的基因突變,而且可以簡(jiǎn)便、快捷的篩查出一些未知的突變。經(jīng)分析得出:新興的HRM技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、成本低、靈敏度高及其特異性高等優(yōu)點(diǎn),可作為ADPKD患者及ADPKD家族攜帶者的突變檢測(cè)與篩查的優(yōu)選方法,適合在臨床推廣。
【關(guān)鍵詞】：高分辨率熔解曲線 常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD) PKD1基因 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 基因突變
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692;R743
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 中英文縮略詞索引14-16
• 前言16-20
• 1 材料與方法20-27
• 1.1 材料20-22
• 1.2 方法22-27
• 2 結(jié)果27-36
• 2.1 血痕提取的DNA純度及濃度檢測(cè)結(jié)果27
• 2.2 長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增結(jié)果27-31
• 2.3 高分辨率熔解曲線檢測(cè)結(jié)果31
• 2.4 測(cè)序結(jié)果31-34
• 2.5 統(tǒng)計(jì)結(jié)果34-36
• 3 討論36-42
• 4 結(jié)論42-43
• 附表43-48
• 附圖48-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 綜述 高分辨率熔解曲線技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展67-85
• 1.高分辨率溶解曲線技術(shù)的原理與特點(diǎn)68-71
• 1.1 高分辨率溶解曲線技術(shù)基本原理68
• 1.2 HRM技術(shù)的發(fā)展與特點(diǎn)68-71
• 2.HRM在分子診斷中的應(yīng)用進(jìn)展71-78
• 2.1 基因突變掃描(GENE SCREENING)71-73
• 2.2 基因分型（GENOTYPING）73-74
• 2.3 序列匹配（SEQUENCE MATCHING）74-75
• 2.4 甲基化研究（METHYLATION ANALYSIS)75-76
• 2.5 SNP分析（INGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM，SNP）76-78
• 2.6 RNA編輯（RNA EDITING）78
• 3.HRM技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和不足78-80
• 4.展望80-81
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在研期間發(fā)表論文及獎(jiǎng)勵(lì)85-86
• 致謝86

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張殿勇,張樹忠,湯兵,張維莉,戴兵,盛茂,孫田美,梅長(zhǎng)林;利用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)中國(guó)漢族人PKD2基因的突變[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年04期

2 邵勇;鐘綺麗;張杰;楊虹;萬峻;胡小平;陳辦成;于波;;高分辨率溶解技術(shù)定量檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血細(xì)胞中CD70啟動(dòng)子低甲基化水平[J];中華實(shí)用診斷與治療雜志;2010年07期

  本文關(guān)鍵詞：常染色體顯性遺傳多囊腎病伴發(fā)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者PKD1基因突變的篩查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：465868