本文關(guān)鍵詞：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對(duì)高糖誘導(dǎo)下小鼠足細(xì)胞線粒體自噬的影響及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景糖尿病腎病(Diabetes nephropathy,DN)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥,并且已經(jīng)成為糖尿病對(duì)生存率危害最大的并發(fā)癥之一。DN是導(dǎo)致終末期腎臟疾病(end stage renal disease,ESRD)的首要獨(dú)立病因。足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病中被認(rèn)為是引起蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵。蛋白尿的產(chǎn)生主要是由于腎小球?yàn)V過屏障(glomerular filtrating barrier,GFB)的完整性受到破壞,進(jìn)而影響其選擇透過蛋白的功能。足細(xì)胞(Podocyte)是體內(nèi)一種高度分化的細(xì)胞,定位于腎小球基底膜外側(cè),其胞體可伸出較自身長度數(shù)倍的一級(jí)和次級(jí)足突,包繞腎小球,相鄰足突之間的直徑為30-40nm的間隙又被滲透性裂孔隔膜(silt diaphragm,SD)所填充。作為腎小球?yàn)V過屏障的最后一層結(jié)構(gòu),足細(xì)胞及SD的完整性對(duì)維持腎小球?yàn)V過功能具有重要作用。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)屬于叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族,在調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、靜止/進(jìn)入細(xì)胞周期、凋亡、增殖、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝及自噬等多種病理生理過程,也在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。研究表明,在使用STZ模擬的的DN鼠腎臟皮質(zhì)中,Fox O1的轉(zhuǎn)錄活性呈抑制狀態(tài)。在真核細(xì)胞內(nèi),線粒體是有氧代謝活動(dòng)發(fā)生的主要場所,因此也是細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要部位。在正常生理狀況下,細(xì)胞可通過包括線粒體自噬(mitophagy)在內(nèi)的一系列途徑清除受損或衰老線粒體,以維持細(xì)胞內(nèi)ROS含量的穩(wěn)定。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)誘導(dǎo)的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)是細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)生成的一種促生存因子,是參與調(diào)節(jié)線粒體自噬的重要功能蛋白之一,在高糖培養(yǎng)下的足細(xì)胞中表達(dá)量下降。有研究表明,在心肌細(xì)胞中PINK1可以作為Fox O1下游基因,參與氧化應(yīng)激刺激中細(xì)胞的生存調(diào)節(jié)。DN發(fā)生時(shí),Fox O1的腎臟保護(hù)作用是否也與活化PINK1,繼而調(diào)節(jié)線粒體自噬,減少ROS過度生成有關(guān),目前尚需進(jìn)一步研究提供證據(jù)。目的觀察Fox O1對(duì)高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞線粒體自噬和線粒體功能的影響及作用機(jī)制。方法構(gòu)建含組成性激活突變型(Constitutively active,CA)和短發(fā)夾RNA(sh RNA)Fox O1編碼序列的慢病毒載體(LV-CA-Fox01、LV-sh Fox O1)、PINK1短發(fā)夾RNA(LV-sh PINK1)及空慢病毒載體(LV-NC)。36只SPF級(jí)雄性KM小鼠,隨機(jī)選取其中27只使用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建DN模型,9只作為正常對(duì)照組(NG組)。造模成功后,將成模鼠隨機(jī)分為3組:糖尿病組(DM組),糖尿病CA-Fox O1轉(zhuǎn)染組(CA組)和糖尿病空病毒轉(zhuǎn)染組(NC組)。小鼠麻醉后,在解剖顯微鏡下右側(cè)腎皮質(zhì)點(diǎn)注射CA-Fox O1慢病毒載體及空慢病毒載體(LV-NC)10μl×3處。于病毒注射后12周末,尾靜脈取血測血糖后麻醉小鼠,迅速剝離出腎臟,置于4%多聚甲醛中固定用于HE檢查,于4%預(yù)冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查。新鮮腎臟于液氮中冷凍,q RT-PCR檢測腎皮質(zhì)中Fox O1m RNA水平,蛋白免疫印跡法檢測各組腎皮質(zhì)中Fox O1、p-Fox O1、PINK1、parkin、p62、MFN2蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在正常糖濃度(5.6mmol/L)培養(yǎng)基中的條件永生性小鼠足細(xì)胞(Conditionally immortalized mouse podocyte cell line,CIMPs)。將細(xì)胞按不同培養(yǎng)環(huán)境及處理分為:(1)正糖對(duì)照組(NG,5.6mmol/L);(2)單純高糖組(HG,25mmol/L);(3)Fox O1上調(diào)組(HG+LV-CA-Fox O1);(4)雙轉(zhuǎn)染組(HG+LV-CA-FOx O1+LV-sh RNA-PINK1);(5)HG+空慢病毒轉(zhuǎn)染組(HG+LV-NC);(6)正常糖+Fox O1下調(diào)組(NG+LV-sh RNA-Fox O1)。各組處理72h后,q RT-PCR檢測(1)-(3)及(6)組Fox O1m RNA表達(dá)水平,蛋白免疫印跡法檢測(1)-(5)組PINK1、Parkin、MFN2、p62蛋白表達(dá)水平;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(1)-(3)及(6)組Fox O1蛋白分布情況;染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)法檢測Fox O1與PINK1啟動(dòng)子的結(jié)合情況;透射電鏡觀察(1)-(5)組線粒體及自噬體;激光共聚焦顯微鏡觀察(1)-(5)組腺病毒載體介導(dǎo)的GFP-LC3與線粒體熒光探針共定位觀測線粒體自噬水平;流式細(xì)胞儀結(jié)合DCFH-DA熒光探針法檢測(1)-(5)組ROS的生成率,JC-1試劑盒測(1)-(5)組細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果1.在DN模型鼠腎皮質(zhì)中,慢病毒轉(zhuǎn)染可上調(diào)Fox O1表達(dá):與NC組相比,DM組Fox O1 m RNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而CA組Fox O1 m RNA水平較DM組明顯上升(P0.05),p-Fox O1/Fox O1比值明顯下降(P0.05)表示高糖可以誘導(dǎo)Fxo O1轉(zhuǎn)錄活性下降。2.上調(diào)Fox O1轉(zhuǎn)錄活性可以增加PINK1/parkin途徑相關(guān)蛋白表達(dá)量,減緩小鼠DN進(jìn)展:蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,CA組PINK1、parkin和MFN2蛋白表達(dá)量明顯高于DM組(P0.05),p62蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于DM組(P0.05)。HE和掃描電鏡染色顯示CA組足突損失、足突融合等病變均較DM組有所減輕。3.轉(zhuǎn)染CA-Fox O1可有效提高CIMPs中Fox O1表達(dá)水平:與(1)組相比,(2)組Fox O1m RNA水平無明顯改變(P0.05),同(2)組相比,(3)組Fox O1m RNA相對(duì)表達(dá)量有所增加(P0.05)。同樣,(6)組同(1)組相比,Fox O1m RNA水平明顯下降(P0.05),說明轉(zhuǎn)染sh-Fox O1可以顯著降低Fox O1整體表達(dá)水平。4.染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,在正常糖培養(yǎng)的CIMPs中,Fox O1可以同PINK1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,高糖環(huán)境可以顯著抑制這一行為(P0.05)。5.與(1)組相比,高糖明顯降低足細(xì)胞中PINK1、Parkin、MFN2的蛋白表達(dá)水平(P0.05),升高p62的蛋白表達(dá)(P0.05);(3)組同(1)相比,轉(zhuǎn)染CA-Fox O1可顯著抑制高糖對(duì)上述指標(biāo)的影響(P0.05);在(4)組中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻斷(P0.05)。6.與(1)組相比,高糖處理和轉(zhuǎn)染Fox O1-sh RNA均可明顯減少足細(xì)胞核內(nèi)Fox O1熒光強(qiáng)度(P0.05);(3)組同(1)相比,轉(zhuǎn)染CA-Fox O1可顯著抑制高糖的影響(P0.05);在(4)組中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻斷(P0.05)。7.與(1)組相比,高糖可以明顯降低足細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位(P0.05);(3)組同(1)相比,轉(zhuǎn)染CA-Fox O1可顯著提高線粒體膜電位(P0.05);在(4)組中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻斷(P0.05)。8.與(1)組相比,高糖明顯升高足細(xì)胞中ROS水平(P0.05);(3)組同(1)相比,轉(zhuǎn)染CA-Fox O1可顯著抑制高糖的影響(P0.05);在(4)組中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻斷(P0.05)。9.透射電鏡結(jié)果顯示,與(1)組相比,高糖環(huán)境中的足細(xì)胞線粒體水腫、嵴斷裂增加,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆�，F(xiàn)象嚴(yán)重。上調(diào)Fox O1后上述現(xiàn)象有所減輕,在此基礎(chǔ)上下調(diào)PINK1后,不能觀察到明顯的損傷改善。10.激光共聚焦顯微鏡所拍攝照片顯示,與(1)組相比,高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞紅綠融合斑點(diǎn)數(shù)量減少(P0.05)。轉(zhuǎn)染CA-Fox O1之后,融合斑點(diǎn)數(shù)量有所上升(P0.05),PINK1 sh RNA的轉(zhuǎn)染可以阻斷這一作用(P0.05)。結(jié)論1.腎皮質(zhì)點(diǎn)注射CA-Fox O1病毒可以減緩糖尿病小鼠DN進(jìn)展,激活PINK1/parkin途徑。2.過表達(dá)FoxO1可以明顯提高高糖狀態(tài)下CIMPs線粒體自噬水平,降低高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷,其機(jī)制可能是通過特異性結(jié)合PINK1基因啟動(dòng)子區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：FoxO1 足細(xì)胞 自噬 氧化應(yīng)激 PINK1
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-15
• 中英文縮略詞15-17
• 前言17-20
• 1 材料與方法20-38
• 2 結(jié)果38-41
• 3 討論41-44
• 4 結(jié)論44-45
• 附圖45-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 綜述 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子FoxO和糖尿病腎病的關(guān)系60-74
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 個(gè)人簡歷74-75
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果75-76
• 致謝76

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本文編號(hào)：464876