本文關鍵詞：前列腺癌特異性雙功能MR分子探針的構建及其體外活性鑒定的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.培養(yǎng)人前列腺癌細胞系PC-3和LNCAP,并分別檢測兩種細胞表面HER2抗原的表達情況;2.構建p QE30-t BID重組表達載體,表達并純化目的蛋白t BID;3.構建前列腺癌特異性雙功能MR分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2,分別檢測探針與兩種前列腺癌細胞結(jié)合的特異性及其對前列腺癌細胞靶向殺傷的能力,并評估其MR特異性成像的可行性。方法:1.常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌細胞系PC-3和LNCAP,在光鏡下分別觀察兩種細胞的形態(tài)以及生長狀況。用流式細胞術分別檢測兩種細胞表面HER2的表達情況。2.根據(jù)t BID的基因序列設計特異性上、下游引物,利用普通PCR技術擴增目的基因t BID,經(jīng)過雙酶切、連接以及轉(zhuǎn)化構建重組表達載體p QE30-t BID,將其轉(zhuǎn)化到表達載體BL21(DE3)中,加入IPTG進行誘導表達,行SDS-PAGE凝膠電泳觀察蛋白t BID的表達情況,鎳親和層析柱純化目的蛋白后用Western Blot鑒定分析。3.利用金磁納米微粒中膠體金可以與蛋白質(zhì)類物質(zhì)相互黏附結(jié)合的特性,分別將抗HER2抗體和活性促凋亡蛋白t BID偶聯(lián)在其表面,構建分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2。4.利用流式細胞術和掃描電鏡分別驗證分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2與兩種前列腺癌細胞PC-3和LNCAP靶向結(jié)合的能力,并采用細胞凋亡檢測試劑盒檢測分子探針對兩種前列腺癌細胞的靶向促凋亡作用。5.將兩種前列腺癌細胞分別與分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2作用后行MRI掃描,觀察各細胞的MRI信號,并分別測量其信號強度,用方差分析比較各組間的信號差異,P0.05差異有統(tǒng)計學意義,從而探討該探針應用于HER2陽性的前列腺癌細胞MR成像的價值。結(jié)果:1.在光鏡下觀察人前列腺癌PC-3細胞呈卵圓形貼壁生長;LNCAP細胞呈梭形貼壁生長;PC-3細胞的生長速度明顯快于LNCAP細胞。2.普通PCR技術擴增后得到分子大小約411 bp的目的基因片段,行菌液PCR鑒定以及重組質(zhì)粒的酶切鑒定,表明重組質(zhì)粒中已含有t BID的基因序列,重組表達載體p QE30-t BID構建成功。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)后,對誘導和未誘導的大腸桿菌的裂解上清樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分析以及考馬斯亮藍染色分析,結(jié)果顯示:與未誘導組相比,IPTG誘導后轉(zhuǎn)化入p QE30-t BID的大腸桿菌在約15 k D處可見與預期分子量大小一致的蛋白條帶出現(xiàn)。Western Blot鑒定證實該蛋白即為目的蛋白t BID。3.流式細胞術結(jié)果顯示PC-3細胞HER2表達為陽性,而LNCAP細胞HER2表達為陰性。4.將抗HER2抗體與t BID蛋白分別與金磁納米微粒偶聯(lián),構建分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2。流式細胞術和掃描電鏡結(jié)果均表明該分子探針可與前列腺癌PC-3細胞特異性結(jié)合,而不能與LNCAP細胞結(jié)合。細胞凋亡實驗檢測結(jié)果顯示探針可與PC-3細胞特異性結(jié)合,并使其發(fā)生早期凋亡,而不能與LNCAP細胞特異性結(jié)合,且對其無明顯促凋亡作用。5.將前列腺癌PC-3細胞和LNCAP細胞分別與分子探針作用后行MRI掃描,T2WI顯示PC-3細胞與分子探針作用組的信號強度明顯減低,而其余各組的信號強度均無明顯減低。PC-3細胞與分子探針作用組與其余各組之間的信號強度差異均有統(tǒng)計學意義,其余各組彼此之間的信號強度差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:本課題以前列腺癌PC-3細胞表面特異性高表達的HER2為靶點,以抗HER2抗體為親和組件,以活性促凋亡蛋白t BID為殺傷組件,以金磁納米微粒為MR信號組件,成功構建雙功能MR分子探針t BID-Gold Mag-Anti HER2。經(jīng)體外細胞實驗驗證該探針可特異性靶向前列腺癌PC-3細胞并促使其凋亡。與探針靶向作用后行MRI掃描,PC-3細胞可在MR上特異性成像。由此,本課題研究構建的MR雙功能分子探針有望為前列腺癌的特異性診斷與靶向性治療的研究奠定實驗基礎。
【關鍵詞】：前列腺癌 分子影像學 人表皮生長因子受體2 細胞凋亡 截短型BID 原核表達 金磁納米微粒
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25;R445.2
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 文獻回顧19-33
• 實驗一 前列腺癌細胞系的培養(yǎng)及其HER2的表達33-40
• 1 材料33-35
• 1.1 細胞系33
• 1.2 主要試劑33-34
• 1.3 主要儀器設備34
• 1.4 主要溶液的配制34-35
• 2 方法35-37
• 2.1 前列腺癌細胞系PC-3 及LNCAP的培養(yǎng)35-36
• 2.2 前列腺癌PC-3 細胞和LNCAP細胞HER2的表達36-37
• 3 結(jié)果37-38
• 3.1 前列腺癌細胞系PC-3 及LNCAP的培養(yǎng)與觀察37
• 3.2 前列腺癌PC-3 細胞和LNCAP細胞HER2的表達情況37-38
• 4 討論38-40
• 實驗二 活性促凋亡蛋白tBID的表達和純化40-53
• 1 材料40-43
• 1.1 菌種及質(zhì)粒40
• 1.2 主要試劑40-41
• 1.3 主要儀器設備41-42
• 1.4 主要溶液的配制42-43
• 2 方法43-47
• 2.1 細菌感受態(tài)的制備43-44
• 2.2 引物的設計與合成44
• 2.3 目的基因tBID的PCR擴增44-45
• 2.4 pQE30-tBID重組質(zhì)粒的構建45-46
• 2.5 目的蛋白tBID的誘導表達46-47
• 2.6 目的蛋白tBID的純化47
• 3 結(jié)果47-51
• 3.1 目的基因tBID PCR擴增產(chǎn)物的鑒定47-48
• 3.2 pQE30-tBID重組質(zhì)粒的構建48-50
• 3.3 目的蛋白tBID的誘導表達及純化50-51
• 4 討論51-53
• 實驗三 tBID-GoldMag-Anti HER2分子探針的構建及其對前列腺癌細胞的靶向性殺傷和MR特異性成像53-65
• 1 材料53-55
• 1.1 細胞系53
• 1.2 主要試劑53-54
• 1.3 主要儀器設備54
• 1.4 主要溶液的配制54-55
• 2 方法55-59
• 2.1 tBID-GoldMag-Anti HER2分子探針的構建55-56
• 2.2 tBID-GoldMag-Anti HER2與前列腺癌細胞的特異性結(jié)合56-57
• 2.3 tBID-GoldMag-Anti HER2促前列腺癌細胞凋亡57-58
• 2.4 tBID-GoldMag-Anti HER2對前列腺癌細胞的特異性MR成像58-59
• 3 結(jié)果59-63
• 3.1 tBID-GoldMag-Anti HER2與前列腺癌細胞的特異性結(jié)合59-61
• 3.2 tBID-GoldMag-Anti HER2促前列腺癌細胞凋亡61-62
• 3.3 tBID-GoldMag-Anti HER2對前列腺癌細胞的特異性MR成像62-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻66-78
• 個人簡歷和研究成果78-80
• 致謝80-81

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