發(fā)布時(shí)間：2017-06-08 22:01

  本文關(guān)鍵詞：STAT3信號通路在腎母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過對腫瘤標(biāo)志物AKT、GSK-3β、Snail在腎母細(xì)胞瘤組織中的免疫組化研究及STAT3對腎母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞增殖,凋亡作用的研究,探討AKT、GSK-3β及Snail與腎母細(xì)胞瘤分級,預(yù)后等各臨床指征間的相關(guān)性,以及STAT3抑制后對腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞株腫瘤干細(xì)胞增殖、凋亡等的影響作用,旨在為腎母細(xì)胞瘤腫瘤治療的基礎(chǔ)研究提供一定的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:本研究分為三部分。第一部分通過對腎母細(xì)胞瘤組織切片進(jìn)行AKT、GSK-3β、Snail免疫組化染色,分析三種腫瘤標(biāo)志物與腎母細(xì)胞瘤各臨床指征間的相關(guān)性;第二部分通過免疫磁珠分選法自腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞株中分選并獲得CD133+細(xì)胞群,并通過細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn),平板克隆實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn),RT-PCR實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)證明CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞性質(zhì);第三部分使用STAT3抑制劑Stattic作用于G401細(xì)胞株中的CD133+細(xì)胞,MTT法檢測在不同給藥濃度(0μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM)Stattic作用下對CD133+細(xì)胞增殖抑制作用,Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染檢測Stattic對CD133+細(xì)胞凋亡的影響,裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測Stattic對CD133+細(xì)胞所成瘤體的抑制作用。WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測Stattic對CD133+細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bcl-xl的影響。結(jié)果:1.AKT、GSK-3β、Snail在腎母細(xì)胞瘤組織中免疫組化染色結(jié)果:AKT的表達(dá)水平與腎母細(xì)胞瘤的臨床分期和轉(zhuǎn)移兩指標(biāo)間具有顯著相關(guān)性(p=0.029,p=0.005);而Snail的表達(dá)水平則與腎母細(xì)胞瘤的臨床分期,轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)三指標(biāo)間具有顯著相關(guān)性(p=0.007,p=0.001,p=0.042),然而,GSK-3β與腎母細(xì)胞瘤各臨床指征間并無顯著相關(guān)(p0.05);Akt與Snail的表達(dá)水平間具有相關(guān)性(p=0.039),而Akt與Snail均與GSK-3β的表達(dá)無顯著相關(guān)(p0.05);AKT、Snail表達(dá)水平高的腎母細(xì)胞瘤患兒,其無病生存期(Disease Free Survival,DFS)、總生存期(Overall Survival,OS)顯著降低(p0.05);而GSK-3β與腎母細(xì)胞瘤患兒的無病生存期及總生存期間并無顯著相關(guān)(p0.05)。2.免疫磁珠分選結(jié)果:分選前經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測G401細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞比例為7.38%,經(jīng)免疫磁珠分選后檢測分選所得細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,其中CD133+腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的比例高達(dá)99.97%。3.細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CD133+腫瘤細(xì)胞較CD133-細(xì)胞及親代腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞球形成能力(p0.05)。4.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CD133+細(xì)胞組形成的克隆數(shù)目顯著高于CD133-細(xì)胞組及親代細(xì)胞組(p0.05)。5.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CD133+細(xì)胞較CD133-細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。6.RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CD133+細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因SOX、NANOG、OCT4的表達(dá)水平均較CD133-組及親代細(xì)胞組更高(p0.05)。7.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果:注射CD133+細(xì)胞組裸鼠的腫瘤形成率及腫瘤大小均高于注射CD133-細(xì)胞組裸鼠。8.MTT法檢測結(jié)果:腎母細(xì)胞瘤CD133+細(xì)胞的存活率隨著Stattic藥物濃度(0-5μM)的逐漸增加,其存活率逐漸降低。在0.625μM和1.25μM的Stattic藥物濃度下,其對細(xì)胞的抑制率分別為25%及46%。9.Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染檢測結(jié)果:經(jīng)Stattic處理后,CD133+細(xì)胞凋亡水平明顯升高,且與Stattic存在濃度依賴性,隨著Stattic濃度的增加,CD133+細(xì)胞的凋亡數(shù)目增高。10.裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過腹腔給藥,Stattic能夠有效抑制CD133+細(xì)胞所成瘤體的生長,給藥第四周,CD133+/Stattic組裸鼠所成瘤體的體積顯著小于CD133+對照組(p0.05)。瘤體的HE染色結(jié)果顯示CD133+/Stattic組較對照組發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,包括染色質(zhì)濃縮,核固縮,細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失等。而對照組細(xì)胞核深染,核分裂象較多,表明細(xì)胞仍在較為活躍的增殖狀態(tài)。11.WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)Stattic處理后p-STAT3的表達(dá)明顯降低,而經(jīng)Stattic處理后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bcl-xl的蛋白表達(dá)水平也隨之下降。結(jié)論:1.AKT的表達(dá)水平與腎母細(xì)胞瘤患兒的臨床分期和轉(zhuǎn)移兩指標(biāo)間具有顯著相關(guān)性;而Snail的表達(dá)水平則與腎母細(xì)胞瘤的臨床分期,轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)三指標(biāo)間具有顯著相關(guān)性;AKT與Snail的表達(dá)水平與腎母細(xì)胞瘤患兒的不良預(yù)后具有顯著相關(guān)。而GSK-3β的表達(dá)水平則與腎母細(xì)胞瘤各臨床指征間無顯著相關(guān)。2.腎母細(xì)胞瘤中CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞性質(zhì),提示著CD133可能為腎母細(xì)胞瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。3.通過靶向抑制其中的STAT3,可有效抑制腎母細(xì)胞瘤CD133+細(xì)胞的生長,加速其凋亡。
【關(guān)鍵詞】：腎母細(xì)胞瘤 AKT GSK-3β Snail CD133 腫瘤干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞8-12
• 前言12-15
• 第一部分 p-AKT, GSK-3β 及Snail與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后間的相關(guān)性研究15-24
• 1 材料與方法15-17
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑15
• 1.3 腎母細(xì)胞瘤組織切片15-16
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法16-17
• 1.4.1 收集腎母細(xì)胞瘤臨床病理組織及切片16
• 1.4.2 腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色分析16
• 1.4.3 腎母細(xì)胞瘤臨床病理指標(biāo)評判16
• 1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法16-17
• 2 結(jié)果17-22
• 2.1 收集腎母細(xì)胞瘤組織切片，，探究各腫瘤標(biāo)志物與腎母細(xì)胞瘤臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性17
• 2.2 各腫瘤標(biāo)志物間的相關(guān)性17
• 2.3 各腫瘤標(biāo)志物與腎母細(xì)胞瘤患者不良預(yù)后間的相關(guān)性17-22
• 3 討論22-24
• 第二部分 腎母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞的分選與鑒定24-37
• 1 材料與方法24-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑24-25
• 1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動物25
• 1.5 常用溶液的配置25
• 1.6 免疫磁珠分選裝置25-26
• 1.7 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 1.7.1 腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞（G401）培養(yǎng)26
• 1.7.2 腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分選前流式細(xì)胞儀檢測26
• 1.7.3 腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞免疫磁珠分選26-27
• 1.7.4 腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分選后流式細(xì)胞儀檢測27
• 1.7.5 腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的體外鑒定27-28
• 1.7.6 腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的體內(nèi)鑒定28
• 2 結(jié)果28-35
• 2.1 流式細(xì)胞儀檢測腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)28-30
• 2.2 CD133+腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的成球能力30
• 2.3 CD133+腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力30-31
• 2.4 CD133+腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力31-33
• 2.5 CD133+腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平更高33-34
• 2.6 CD133+細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性34-35
• 3 討論35-37
• 第三部分 STAT3對腎母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞特性及凋亡的影響37-44
• 1 材料與方法37-40
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器37
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑37-38
• 1.3 常用溶液的配置38
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn)38
• 1.4.2 Annexin V凋亡檢測38-39
• 1.4.3 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白39
• 1.4.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察抑制STAT3對腎母細(xì)胞瘤干細(xì)胞成瘤能力的影響39
• 1.4.5 裸鼠瘤體HE染色39-40
• 2 結(jié)果40-43
• 2.1 MTT法檢測Stattic有效抑制濃度40
• 2.2 Annexin-V-FITC/PI雙染檢測Stattic促進(jìn)了CD133+細(xì)胞的凋亡40-41
• 2.3 Stattic有效抑制CD133+細(xì)胞所成瘤體的生長41-42
• 2.4 腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織HE染色情況42
• 2.5 WesternBlot法檢測STAT抑制劑能夠有效抑制STAT3磷酸化，并促進(jìn)了腎母細(xì)胞瘤CD133+細(xì)胞的凋亡42-43
• 3 討論43-44
• 全文總結(jié)44-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 在學(xué)期間的研究成果52-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Xiu-Fen Zheng;Yue-Dong Sun;Xue-Yan Liu;;Correlation of expression of STAT3,VEGF and differentiation of Th17cells in psoriasis vulgaris of guinea pig[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2014年04期

2 張華;李蘇宜;;CD133與腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];癌癥;2010年03期

  本文關(guān)鍵詞：STAT3信號通路在腎母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：433792