目的：觀察ADO信號通路對腎間質纖維化過程的影響。方法：(1)動物分組：共44只雄性小鼠,采取隨機分組的方式,分成3個組別：其中,假手術組(Sham)12只,模型組(UUO)16只,干預組(PT)16只。干預組在單側輸尿管結扎(UUO)基礎上予茶堿(8-PT)10mg/kg·d腹腔注射(1次/天),模型組在UUO基礎上予生理鹽水腹腔注射。于實驗第1、3、7、14天分批次對小鼠進行處死操作,其中,假手術組實驗小鼠,每次處死只數為3只,而模型組和干預組這兩個組別的小鼠,每次處死的只數為4只。在處死前24小時將小鼠置入代謝籠內收集24小時尿測定尿肌酐(UCr)、β2微球蛋白(β2-MG)含量；處死前1.5小時通過小鼠陰莖靜脈注射低氧探針Hypoxy probe-1(60mg/kg)。小鼠處死后,留取進行了結扎處理一側的腎組織,開展后續(xù)的形態(tài)學以及免疫組織化學兩個方面的研究。(2)觀察指標：通過對腎組織進行HE以及Masson染色處理后,觀察三個不同實驗組的小鼠腎組織中腎小管受損的程度、腎間質中炎性細胞的侵潤狀況以及腎間質纖維化程度；運用免疫組織化學技術觀察實驗對象的腎小管上皮細胞和間質細胞的...

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摘要
Abstract
符號說明
前言
第一章 腺苷通路誘導腎間質纖維化的形態(tài)學研究
    1 材料和方法
        1.1 動物來源
        1.2 主要試劑與溶液配置
            1.2.1 免疫組織化學試劑
            1.2.2 主要溶液配置
        1.3 主要儀器
        1.4 實驗方法
            1.4.1 動物模型制備及分組
            1.4.2 腎組織標本的處理流程
            1.4.3 HE染色步驟
            1.4.4 Masson's的三色染色流程
            1.4.5 免疫組織化學方法的運用和具體的實施步驟
        1.5 指標觀察及定量分析
            1.5.1 小鼠腎小管損傷程度評分
            1.5.2 小鼠腎間質纖維化程度判斷
            1.5.3 腎小管和腎間質PCNA陽性表達率
            1.5.4 腎組織缺氧程度的半定量化測定
        1.6 腎組織腺苷濃度的測定
            1.6.1 色譜條件
            1.6.2 腺嘌呤核苷酸的提取
            1.6.3 樣品的測定和數據分析
        1.7 小鼠腎功能測定
            1.7.1 標本收集
            1.7.2 尿肌酐(UCr)、β₂微球蛋白(β₂-MG)含量,采用中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科全自動生化分析儀一次性檢測
        1.8 統(tǒng)計學處理
    2 結果
        2.1 腎組織腺苷濃度的升高導致小鼠腎間質纖維化
        2.2 茶堿能減輕腎組織纖維化程度,對腎組織具有保護作用
    3 討論
第二章 腺苷通路導致腎間質纖維化的分子機制研究
    1. 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 動物來源
            1.1.2 主要的實驗試劑
            1.1.3 主要溶液配置
            1.1.4 引物設計和合成處理
            1.1.5 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 動物模型制備和分組
            1.2.2 腎組織總RNA抽提及鑒定
            1.2.3 對于基因組中DNA進行去除處理
            1.2.4 逆轉錄(RT)反應(20μl體系)
            1.2.5 Real time PCR(25μl體系)
            1.2.6 Real time PCR結果判斷
            1.2.7 腎組織形態(tài)學的檢測流程
            1.2.8 免疫組織化學方法及步驟
            1.2.9 TGF-β₁、α-SMA免疫組化定量分析
        1.3 統(tǒng)計學處理
    2 結果
        2.1 促纖維化因子TGF-β₁、PAI-1、α₁(Ⅰ)procollagen mRNA在RIF小鼠腎組織中的動態(tài)變化以及不同濃度的ADO對該變化的影響
            2.1.1 TGF-β₁ mRNA在腎臟出現(xiàn)纖維化病變過程中的表達規(guī)律以及阻斷ADO信號通路對TGF-β₁ mRNA的影響
            2.1.2 PAI-1 mRNA在腎臟出現(xiàn)纖維化病變過程中的表達規(guī)律以及阻斷ADO信號通路對PAI-1 mRNA的影響
            2.1.3 a,(I)procollagen mRNA在腎臟出現(xiàn)纖維化病變過程中的表達規(guī)律以及阻斷ADO信號通路對a 1 ( I ) procol lagen mRNA的影響
        2.2 各實驗組TGF-β₁、α-SMA在腎組織中的表達及分布規(guī)律
            2.2.1 各實驗組TGF-β₁在腎組織中的表達及分布規(guī)律
            2.2.2 各實驗組α-SMA在腎組織中的表達及分布規(guī)律
    3 討論
第三章 腺苷通路對腎成纖維細胞生物學行為的影響
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 細胞來源
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 方法與步驟
            1.2.1 PCR反應引物
            1.2.2 RNA提取步驟
            1.2.3 基因組DNA的去除步驟
            1.2.4 逆轉錄(20μl體系)反應
            1.2.5 Real-time PCR(25μl體系)實時熒光法
            1.2.6 Real-Time PCR(50μl體系)TaqMan探針法
            1.2.7 Real-time PCR擴增程序
            1.2.8 不同的藥物對成纖維細胞的處理及分組
            1.2.9 MTT方法檢測細胞毒性(生長曲線)
        1.3 統(tǒng)計學處理
    2 結果
        2.1 腎成纖維細胞表面腺苷受體的表達
        2.2 不同處理條件下腎成纖維細胞表達促纖維化因子TGF-β₁、α₁(Ⅰ)procollagenmRNA以及α-SMA mRNA的變化
            2.2.1 TGF-β₁ mRNA在不同藥物干預下的表達規(guī)律
            2.2.2 α₁(Ⅰ)procollagen mRNA在不同藥物干預下的表達規(guī)律
            2.2.3 α-SMA mRNA在不同藥物干預下的表達規(guī)律
        2.3 不同干預條件對腎成纖維細胞增殖的影響
    3 討論
總結
展望
參考文獻
綜述
攻讀學位期間主要的研究成果
致謝



本文編號：3900254